[发明专利]蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法

说明书

本申请公开了蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法：取新鲜蚕豆根系；液氮研磨；酚抽提液；Tris平衡酚饱和溶液；离心收集上层酚；0.1mol/L醋酸铵‑甲醇溶液；离心收集沉淀；甲醇清洗；离心收集沉淀；真空干燥沉淀；加入样品裂解液；离心取上清；蛋白定量；分装冷冻；样品水化；样品制备完成。本发明以蚕豆根系为实验材料，填补了蚕豆根系双向电泳技术的空白。本发明中实验步骤简单，易于操作，重复性好，有实验背景的技术人员易学、易掌握。本发明中选用的实验试剂均为双向电泳常规试剂，无昂贵、稀有试剂，实验运作成本低。

技术领域

本申请属于生物化学领域，具体涉及一种蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法。

背景技术

随着人类基因组计划的全面实施与推进，生命科学已经进入了后基因组时代，其主要研究对象已转变为功能基因组学的研究。

蛋白质组学(Proteomics)是以活细胞内基因组编码的全部蛋白质为研究对象，其研究被认为是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一且日趋成为研究热点而备受关注。

双向电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)可以对生物细胞或组织全蛋白质表达进行定性或定量的综合分析，尤其是用于揭示不同条件下蛋白质表达的变化。蛋白质样品的制备是双向电泳的第一步，也是最重要的一步，样品制备的好坏直接影响到随后蛋白的分离及最后分析结果的可靠性。作物不同器官的蛋白质组成特征是有差异的，样品制备方法要根据不同实验材料进行选择，针对材料选择特异的提取方法可以得到更好的分离效果。样品制备分为蛋白质的提取、裂解液配方的选择、杂质的去除等步骤，在处理样品的时候，如果这些步骤中的任何一步没有充分完成，分离可能不完全或失败，并且，一些信息也可能丢失。因此样品的制备极为关键，而建立有效的样品制备方法，高分辨地分离蛋白质一直是植物蛋白质组学研究中双向凝胶电泳技术不断改进的方向。

有关植物组织蛋白质提取方法的研究有很多，然而，没有一种方法适用于所有植物组织。由于根系组成成分复杂、研磨困难，影响根系中色素类、酚类和醌类等物质的清除，故根系蛋白提取方法不同于其他器官的蛋白提取方法。在已报道的作物根系蛋白提取方法中，三氯醋酸/丙酮法、普通的酚抽提法、Tris-HCl法、TCA/丙酮法均有使用，但不同作物其根系的蛋白质组成特征是有差异的，针对材料选择特异的提取方法可以得到更好的分离效果。三氯醋酸/丙酮法是进行蛋白质组学分析最常用的提取方法，提取过程中损失较少，具有广泛的适用性，在拟南芥中取得了很好的分离效果；普通的酚抽提法在油菜、紫花苜蓿根系的蛋白提取中效果最佳；改良后的TCA/丙酮法在水稻、黄瓜、西瓜等作物的根系蛋白提取中提取效果最好，为适宜的蛋白提取方法。

有关豆科植物根系蛋白质提取方法鲜有报道，而适合于蛋白质组学分析的蚕豆根系总蛋白提取方法更是未见报道，已报道的豆科植物根系总蛋白提取方法中发现不同的豆科作物在提取根系总蛋白时采用的方法也不同，紫花苜蓿采用酚抽提法(王继峰，2007)、籽粒苋根系采用Tris-HCl法(晋海军，2015)。

蚕豆关于蛋白方面研究起步较晚，主要研究集中在食品加工级别的蛋白提取、分离、功能特性研究等方面，而在蛋白质组学方面只有理论综述，而没有实质性的工作进展。为了加快蚕豆蛋白质组学研究步伐，为蚕豆蛋白质组学研究奠定理论基础和技术指导需要建立适合于蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，为开展蚕豆双向电泳技术迈出第一步。

发明内容

有鉴于此，本申请所要解决的技术问题是现有技术中没有通用、有效、适合于蚕豆的蛋白质组学分析样品的制备方法。提供一种适合蛋白质组学分析的蚕豆根系样品制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜蚕豆根系；

(2)将所取样品置于预冷至-20℃的研钵内，用液氮快速冷冻并充分研磨至细粉；