[发明专利]蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法

权利要求书

1.蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取新鲜蚕豆根系；

(2)将所取样品置于预冷至-20℃的研钵内，用液氮快速冷冻并充分研磨至细粉；

(3)研磨好的粉末中加入10倍体积酚抽提液，不定时涡旋混匀等待20min后，加入等体积的Tris平衡酚饱和溶液pH8.0，4℃放置30min，期间每5min摇晃混匀一次；离心后收集上层酚液；

(4)向步骤(3)所述的上层酚液中加入预冷的0.1mol/L醋酸铵-甲醇溶液，-20℃沉淀过夜后，离心收集沉淀；

(5)步骤(4)所述的沉淀中加入5倍体积的预冷甲醇，轻微混合后，4℃离心，弃上清液，沉淀中加入预冷丙酮，轻微混合，4℃离心，收集沉淀；

(6)步骤(5)所得的沉淀真空干燥至水分≤8％，得粉末；

(7)步骤(6)所得粉末溶解液于样品裂解液，23℃下放置3h以上，期间涡旋混匀2～3次；

(8)裂解结束后，离心取上清液，上清液再次离心，取上清液作为待分析溶液；

(9)绘制标准曲线，取待分析的上清液与考马斯亮蓝蛋白试剂反应，测定吸光值，根据标准曲线测定待分析溶液中蛋白质的浓度；

样品蛋白浓度μg/μl＝X/样品体积μl；

样品蛋白含量Xμg＝(Y-0.0108)/0.015；

式中，X为样品蛋白含量，Y为样品的吸光值；

(10)按根系蛋白总上样量200μg，上样总体积 350μl，计算蛋白体积，并分装后-80℃保存；

样品蛋白体积μl＝200μg/样品蛋白浓度

(11)从-80℃取出蛋白样品，自然溶解后按上样总体积 350μl和蛋白体积，计算出水化液体积，加入蛋白样品水化液，离心，即得蚕豆根系蛋白质组学分析样品；

水化液体积＝350μl-蛋白体积；

步骤(3)中所述的酚抽提液为0.7mol/L蔗糖、0.1mol/LNaCl、0.5mol/L Tris-HClPH7.5、50mmol/L EDTA-2Na和0.2％DTT的混合溶液；所述的离心条件为5000×g，10min；

步骤(4)中加入的醋酸铵-甲醇溶液的量为上层酚液体积的5倍；预冷至-20℃。

2.根据权利要求1所述的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的离心条件为12000×g，10min。

3.根据权利要求1所述的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的离心条件都为12000×g，10min。

4.根据权利要求1所述的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤(7)中所述的样品裂解液为8mol/L尿素、2％聚乙二醇辛基苯基醚、60mmol/L二硫苏糖醇的混合溶液。

5.根据权利要求4所述 的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤(9)中蛋白浓度标准曲线以牛血清蛋白为标准蛋白，以Bradford方法绘制。

6.根据权利要求5所述的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤(9)中所述考马斯亮蓝蛋白试剂包括：质量浓度为0.01％的考马斯亮蓝G-250，质量浓度为4.75％的乙醇和质量浓度为8.5％的磷酸；反应时间为5min，检测波长为595nm。

7.根据权利要求6所述的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤(11)中所述蛋白样品水化液包括：7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％CHAPS，65mmol/L二硫苏糖醇，0.2％载体两性电解质和0.001％溴酚蓝。

8.根据权利要求7所述的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤(8)和步骤(11)中的离心条件均为4℃、20000×g下离心20min。