[发明专利]一种大分子DNA的体外无缝组装方法

摘要

本发明提供了一种大分子DNA的体外无缝组装方法，能通过“分段+分步酶促组装”模式实现大分子DNA的无缝组装的目标的方法，其有益效果在于：1、利用拼接碱基将大片段DNA分子分成若干个小片段，降低了PCR的难度，并由于拼接碱基的存在实现了分步无缝组装的目标。2、与传统的酶切连接方法相比，本发明不依赖于连接，几乎不受到酶切位点的限制。3、克服了传统酶切连接方法和位点特异性重组方法容易引入额外碱基的缺点，实现了分步无缝连接的目的。4、本发明的方法比多个片段一步克隆酶促组装具有更可控的组装成功率和更高的序列准确率。

主权项

一种大分子DNA的体外无缝组装方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一)分析被组装序列的酶切位点，获得不出现在被组装序列中的限制性内切酶的酶切位点并选择其中一个限制性内切酶作为组装酶；组装酶酶切载体使载体线性化后，线性化载体两个末端所残留的部分酶切位点识别序列分别作为该组装酶的两个拼接碱基，根据两个拼接碱基在被组装序列中的分布情况选用合适的拼接碱基并根据所选用的拼接碱基确定对应的组装方向；步骤二)选择合适数目的拼接碱基将被组装序列分为两个或两个以上DNA组装片段；设计一套PCR扩增DNA组装片段的重叠引物对；步骤三)用组装酶线性化骨架载体，用步骤二设计的重叠引物对进行PCR扩增，获得所需要的组装片段；回收酶切获得的线性化骨架载体和PCR获得的组装片段，并通过粘性末端酶的酶促组装反应将第一个片段装配到骨架载体中；步骤四)重复步骤三，根据确定的组装连接顺序将DNA组装片段分步组装到骨架载体上，形成最终所需要的载体。