[发明专利]体外维护人淋巴细胞基因组稳定性叶酸浓度检测方法

摘要

本发明涉及分子生物技术领域，具体来说是一种体外维护人淋巴细胞基因组稳定性叶酸浓度检测方法，步骤包括设计培养基；淋巴细胞分离；淋巴细胞培养；细胞收集及制片；片子分析；统计分析；本发明利用体外培养人外周血淋巴细胞，设置不同的叶酸浓度，以CBMN Cyt检测体外维护人淋巴细胞基因组稳定性的最适浓度，测得的体外维护人体淋巴细胞基因组稳定性的最适浓度是120nmol/L，所得结果更贴近活体，为个体的营养干预，以及有效维护个体基因组稳定性提供重要依据。

主权项

体外维护人淋巴细胞基因组稳定性叶酸浓度检测方法，其特征在于，步骤包括：(1)设计培养基：根据人体血液中叶酸含量，设置30nM、60nM、120nM、240nM的叶酸浓度并配置成10ml，培养基其他成分及浓度与RPMI‑1640培养基一致；(2)淋巴细胞分离：①静脉取血5ml于干净无菌有肝素的试管中，加入等体积的HBSS液混合均匀；②再另取两只离心管分别加入2ml淋巴细胞分离液，将5ml稀释血样加入铺在淋巴细胞分离液表面，使血液与淋巴细胞分离液形成明显的分离界面，盖紧离心管盖；③2000r/min，离心30min后将细胞液吸出，将同一样本淋巴细胞移入另一离心管中；室温下加入细胞液体积3倍的HBSS混匀，1000r/min，离心10min，弃上清后加入细胞液体积2倍的HBSS混匀，1000r/min，离心10min，弃上清后加入细胞液体积2倍的HBSS混匀，1000r/min，离心10min，去上清后加入没有叶酸的培养基0.2ml；④取10ul的细胞液加至EP管中，再取10ul的体积浓度为0.4％苔酚兰加至EP管中，充分混合，放置2min，取20ul的混合液滴加到细胞记数板与盖片的缝隙间，让细胞液自动进入记数板内，在显微镜下直接进行记数，4个大方格的活细胞数A，细胞总算＝A/4×稀释倍数×104×离心管中细胞悬浮液的体积；(3)淋巴细胞培养：①计算并培养：将分离的淋巴细胞分到不同的培养体系中，使细胞终浓度保持在0.5‑1×106个/ml，加入设置的特殊培养基800‑1000ul，向培养基中加入终浓度为30ug/ml的PHA，将淋巴细胞放在37℃下培养；②计数并换培养基：将培养离心管中的细胞液混匀，吸取10ul细胞混合液按上述计数方法计数，计算后按1000rpm/min，离心10min去上清，根据计数结果按照0.5×106个/ml的比例加入新鲜培养液，但不加PHA，继续培养；③CB培养：取浓度为600ug/ml的CB储备液100ul，加入900ul无叶酸培养基，并将CB加入培养物中使其CB浓度为4.5ug/ml，继续培养28h后收集细胞；(4)细胞收集及制片：用含DMSO为7％的培养基处理细胞10min后，每个离心孔加入80ul混合细胞液，800rpm，5min的条件下TXD3细胞涂片离心机涂片，涂片后的载玻片在室温条件下干燥10min，将片子放入新配置的甲醇：冰醋酸为3:1的固定液中，固定10min后空气干燥，将干燥的片子在Giemmsa染液中染色5min后空气干燥，干燥的片子在二甲苯中透明处理5min，干燥后用中性树胶封片；(5)片子分析：在光学显微镜×1000镜头下，计数CBMN各项指标，每例样本的各叶酸受试浓度组分析2000‑3000个双核细胞，设相应对照；(6)统计方法：叶酸对基因组稳定性影响用SPSS15.0软件的ANOVA进行分析，结果为体外维护人体淋巴细胞基因组稳定性的浓度是120nmol/L。