[发明专利]体外维护人淋巴细胞基因组稳定性叶酸浓度检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体来说是一种体外维护人淋巴细胞基因组稳定性叶酸浓度检测方法。

背景技术

基因组携带着构成和维持人类生命形式必需的所有生物信息，使人类在长期的进化过程中不仅能够正常进行各项生命活动，而且可将适应环境的各种性状稳定地遗传给后代，这些都以人类基因组的相对稳定作为前提。随着对表观遗传现象的深入研究和基因组信息知识的不断拓展，人们发现除了基因突变、染色体畸变、非整倍体引起的基因剂量改变、及染色体断裂-融合-桥(breakage-fusion-bridge,BFB)循环导致基因扩增等造成基因组损伤外，DNA甲基化、基因组印迹等不涉及DNA序列改变的转录调控修饰现象亦会影响基因组的稳定性。这些遗传损伤和表观遗传现象往往是癌症早期的关键事件，而基因组稳定性的下降还可能与发育异常、糖尿病、心血管病、早老性痴呆和神经退行性疾病等慢性疾病有关。

引起基因组不稳定的诱因，除接触外源性物理(如辐射)和化学因素(如致癌物或诱变剂)能够直接引起人类体细胞与生殖细胞基因组重大改变外，膳食中微量营养素(micronutrients)通过其摄入状态、参与活化/解毒过程、DNA合成及修复、细胞凋亡及表观遗传修饰模式改变等多种途径来影响基因组的稳定性。对微量营养素的适当补充，能够保证机体正常生理功能的发挥，有助于克服维持DNA稳定性关键途径中遗传性代谢障碍，同时影响DNA甲基化模式改变，减少基因组内源性因素的损伤，降低肿瘤的易感性。

一碳单位代谢是膳食中营养组分与遗传物质作用研究机制的重要切入点。叶酸(Folate)正是人体一碳代谢反应必需的一组微量营养素，除稳定性最高的氧化态叶酸(Folic acid，FA)外，各种还原态叶酸在机体一碳单位的代谢和甲基传递的过程发挥了不可或缺的作用。叶酸代谢主要涉及DNA合成、修复与DNA甲基化两个重要的生化过程：前者主要包括尿嘧啶脱氧核苷酸(dUMP)到胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)的合成，后者通过合成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)影响DNA、蛋白质等分子的甲基化。人体自身不能合成叶酸，必须通过饮食从外界摄入。倘若叶酸摄入不足会导致dTMP合成受阻，dUMP过量积累掺入DNA，影响继后的DNA复制和修复过程，并诱发碱基错配、基因突变、DNA单双链断裂、染色体的断裂等遗传结构损伤；同时引起机体绝大多数甲基化反应的主要甲基供体-SAM的储量变化，而使全基因组DNA甲基化程度和DNA特殊位点甲基化模式改变，导致基因表达方式改变、着丝粒异染色质凝聚水平下降等遗传毒性和表观遗传毒性事件发生。

胞质阻断微核细胞组分析(CBMN Cyt)为主要实验方法，除了可以评价染色体断裂、DNA错配、染色体丢失、染色体不分离、细胞坏死和细胞凋亡等各个指标外，“细胞组”概念更意味着基于机体中单个细胞的水平来综合评价这些细胞的生活状态(包括细胞坏死和凋亡)，分裂状况(包括单核、双核及多核细胞的计数)，以及细胞的染色体损伤或不稳定的情况(以微核、核质桥、核芽为主要标志)，还可结合双核细胞中细胞核与微核着丝粒探针信号分析。利用该方法探讨在体外培养体系中，叶酸维持人体外周血淋巴细胞基因组稳定性的最适浓度。CBMN方法评价指标包括遗传毒性(微核、核质桥及核芽)，细胞毒性(坏死与凋亡细胞率)，和细胞生长抑制(单核、双核、多核细胞比例，NDI指数)，遗传毒性指标为寻找维持离体培养人类淋巴细胞基因组稳定的最佳叶酸浓度提供依据，该方法利用人体的外周血分离淋巴细胞进行体外培养，得到的数据比传统的动物模型试验更贴近人类活体状况，为进行个体营养干预，从而有针对地提高个体基因组稳定性，减少相关疾病的发生有积极意义。

发明内容

本发明的目的旨在设计一种方法能有效的检测在体外培养的条件下，维护人淋巴细胞基因组稳定性的叶酸最适浓度，进而为后续的营养干预，以及有效维护个体基因组稳定性提供重要的科学依据。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种体外维护人淋巴细胞基因组稳定性叶酸浓度检测方法，步骤包括：

(1)设计培养基：根据人体血液中叶酸含量，设置30nM、60nM、120nM、240nM的叶酸浓度并配置成10ml，培养基其他成分及浓度与RPMI-1640培养基一致；

(2)淋巴细胞分离：

①静脉取血5ml于干净无菌有肝素的试管中，加入等体积的HBSS液混合均匀；