[发明专利]双表达小干扰RNA的复制缺损型乙型肝炎病毒载体、其制备方法及应用有效
| 申请号： | 201610821379.1 | 申请日： | 2016-08-29 |
| 公开（公告）号： | CN106399374B | 公开（公告）日： | 2019-07-05 |
| 发明（设计）人： | 孙殿兴;李保胜;孙烁;李敏然;程欣 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军联勤保障部队第九八〇医院 |
| 主分类号： | C12N15/86 | 分类号： | C12N15/86;C12N15/66;C12N15/867;C12N15/861;C12N15/864 |
| 代理公司： | 石家庄科诚专利事务所(普通合伙) 13113 | 代理人： | 张红卫 |
| 地址： | 050086 河*** | 国省代码： | 河北;13 |
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| 摘要： | 本发明提供了一种双表达小干扰RNA的复制缺损型乙型肝炎病毒载体、其制备方法及应用，以表达野生型HBV的质粒pCH‑9/3093为载体进行基因修饰，构建HBV‑shRNA双表达载体：首先，通过点突变，在基因组各蛋白起始密码ATG后添加终止密码；其次，将C基因区的203‑407位和S基因区的1715‑1961位的序列删除；最后，再在两个基因区分别插入H1‑shRNA表达框和U6‑shRNA表达框，构建双表达小干扰RNA的复制缺损型乙型肝炎病毒载体；本发明构建的双表达小干扰RNA的复制缺损型乙型肝炎病毒载体pCH‑203H1shG‑1715U6shG，抑制hrGFP的表达；构建的双表达小干扰RNA的复制缺损型乙型肝炎病毒载体pCH‑203H1sh6‑1715U6sh8，抑制HBV的表达与复制。本发明适用于双表达小干扰RNA的复制缺损型乙型肝炎病毒载体及其制备。 | ||
| 搜索关键词： | 乙型肝炎病毒 小干扰RNA 缺损 复制 构建 制备 表达载体 基因修饰 起始密码 序列删除 终止密码 基因区 基因组 通过点 野生型 质粒 突变 应用 蛋白 | ||
【主权项】：
1.一种双表达小干扰RNA的复制缺损型乙型肝炎病毒载体，其特征在于：以表达野生型 HBV的质粒pCH‑9/3093为载体进行基因修饰，构建HBV‑shRNA双表达载体：首先，通过点突变，在基因组各蛋白起始密码ATG后添加终止密码；其次，将C基因区的203‑407位和S基因区 的1715‑1961位的序列删除；最后，在C基因区的203‑407位之间插入H1‑shRNA表达框；在S基因区的1715‑1961位之间插入U6‑shRNA表达框，构建双表达小干扰RNA的复制缺损型乙型肝炎病毒载体，其中，所述的H1‑shRNA表达框包括H1启动子、shRNA序列和终止信号T6；所述的U6‑shRNA表达框包括U6启动子、shRNA序列和终止信号T6；所述的H1‑shRNA表达框中的shRNA序列为靶向S基因区内的1698‑1716位的sh6，所述的U6‑shRNA表达框中的shRNA序列为靶向S基因区内的1953‑1971位的sh8；所述的H1启动子和U6启动子的长度分别为103和122bp；所述点突变的突变点包括：核心区‑G28T、聚合酶区‑T444A、 preS1区‑C954T、preS2区‑C1275T、S区‑C1482T以及X区‑C2677T。
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