[发明专利]双表达小干扰RNA的复制缺损型乙型肝炎病毒载体、其制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种双表达小干扰RNA的复制缺损型乙型肝炎病毒载体、其制备方法及应用，以表达野生型HBV的质粒pCH‑9/3093为载体进行基因修饰，构建HBV‑shRNA双表达载体：首先，通过点突变，在基因组各蛋白起始密码ATG后添加终止密码；其次，将C基因区的203‑407位和S基因区的1715‑1961位的序列删除；最后，再在两个基因区分别插入H1‑shRNA表达框和U6‑shRNA表达框，构建双表达小干扰RNA的复制缺损型乙型肝炎病毒载体；本发明构建的双表达小干扰RNA的复制缺损型乙型肝炎病毒载体pCH‑203H1shG‑1715U6shG，抑制hrGFP的表达；构建的双表达小干扰RNA的复制缺损型乙型肝炎病毒载体pCH‑203H1sh6‑1715U6sh8，抑制HBV的表达与复制。本发明适用于双表达小干扰RNA的复制缺损型乙型肝炎病毒载体及其制备。

技术领域

本发明属于医学领域，涉及一种乙型肝炎病毒载体，具体涉及一种双表达小干扰RNA的复制缺损型乙型肝炎病毒载体、其制备方法及应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)是一种以逆转录方式复制的DNA病毒，其基因组结构紧凑，长度只有3.2kb。据WHO估计，全球有2.4亿人慢性感染HBV，HBV是导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌等终末肝病的主要致病因素。当前正式批准用于临床的药物包括干扰素(IFN)和核苷(酸)类似物(NAs)，但IFN治疗常常受限于药物不良反应，NAs类药物往往需要患者终生服药，这是由于宿主细胞核内持续存在共价闭合环状(ccc)DNA。以cccDNA为模板转录产生前基因组RNA(pgRNA)以及几种亚基因组RNA，NAs可以有效的抑制pgRNA的逆转录复制，进而阻断新病毒的产生，但并不能影响亚基因组RNA产生多种病毒抗原，而研究发现大量产生的病毒抗原会影响获得性免疫应答，因此不能减少病毒抗原成为NAs治疗的一个缺憾。

RNA干扰(RNAi)是一种强有力的基因沉默技术，能够抑制许多种病毒的复制。RNAi对HBV复制及基因表达的抑制效应尤其明显，因为HBV的复制直接依赖于pgRNA，而且HBV的多种转录产物共用3’端的重叠序列，所以只需一个RNAi效应子就可以靶向抑制病毒的多条RNA。然而，抗HBV的RNAi疗法走向临床还面临诸多严重的挑战，其中包括脱靶效应和刺激产生有害的免疫反应，尽管近年在siRNA非病毒载体的化学稳定性和递送的器官靶向性方面取得了长足的进步，但在彻底清除cccDNA池或者说达到免疫控制之前，合成的siRNA仍需要多次重复给药。载体表达的短发夹RNA(shRNA)也面临如何靶向性递送到肝脏并且到达所有肝细胞的问题，采用病毒载体可以实现高效的递送，例如腺病毒(Ad)、腺相关病毒(AAV)以及慢病毒，然而，非整合病毒载体只能短暂的表达shRNA，也需要重复给药，这可能要受到抗病毒免疫应答的影响，对于整合病毒载体来说，则有插入突变、异常拼接等危险。

如果把HBV作为递送shRNA的载体，以一种在特定条件下才具有复制能力的工作方式，则有希望克服前述大部分的难题。像自发产生的复制缺损型HBV病毒颗粒一样，HBV载体作为真正的HBV具有肝组织靶向性，经过设计，在居住病毒反式互补作用下可以产生新的载体颗粒并播散，并且当野生型(wild-type，wt)HBV消失后载体的播散即停止。但将HBV改造为载体要克服几个重要的难题，首先是HBV的基因组结构非常紧凑，每一个核苷酸都是某个开放读码框(open reading frame，ORF)的编码核苷酸，并且超过半数的核苷酸处于两个ORF内；而且，所有的调节原件诸如启动子、增强子以及众多的复制顺式作用元件，都与ORF重叠，因此，即使是所需的反式互补因子全部存在的情况下，不恰当的基因序列编辑也很容易导致载体的复制能力受损。第二，所递送的shRNA必须有效地靶向HBV，而且shRNA能达到产生设计沉默效应水平所需要的数量，还要把脱靶效应降至最小。第三，载体产生的shRNA不能靶向载体自身。至少，用HBV载体重复感染已经感染HBV的细胞看上去无效，但在NAs治疗时，野生型HBV最终被耐NA变异病毒取代，这种现象显示重复感染的确发生了，而且，在土拨鼠肝炎病毒模型中直接显示了重复感染的现象。

因此，研究一种HBV-shRNA双表达载体及其构建方法，具有重要的意义。