[发明专利]一种快速区分6种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析方法

摘要

本发明公开了一种快速区分6种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析方法。本发明操作简单，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素‑藻红蛋白进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值，分辩不同类型的病毒。本发明方法，能够同时对禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。

主权项

1.一种用于快速区分6种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析引物组，其包括：用于检测禽流感病毒的引物对A1和A2、用于检测鸡传染性支气管炎病毒的引物对B1和B2、用于检测鸡新城疫病毒的引物对N1和N2、用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的引物对L1和L2、用于检测鸡毒支原体的引物对G1和G2、用于检测鸡滑液囊支原体的引物对S1和S2，其特征在于：所述用于检测禽流感病毒的引物对是根据禽流感病毒的M基因的保守序列设计的；所述用于检测鸡传染性支气管炎病毒的引物对是根据鸡传染性支气管炎病毒的N基因保守序列设计的；所述用于检测鸡新城疫病毒的引物对是根据 鸡新城疫病毒的F基因的保守序列设计的；所述用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的引物对是根据鸡传染性喉气管炎病毒的gD基因的保守序列设计的；所述用于检测鸡毒支原体的引物对是根据鸡毒支原体的PVPA基因的保守序列设计的；所述用于检测鸡滑液囊支原体的引物对是根据鸡滑液囊支原体的vlhA基因的保守序列设计的；其特征在于，用于检测禽流感病毒的引物对的核苷酸序列如下所示：A1：5’‑ATGAGTCTTCTACCCGAGG‑3’，A2：5’‑TCAGAGGTGACAGGATTG‑3’；用于检测鸡传染性支气管炎病毒的引物对的核苷酸序列如下所示：B1：5’‑AATCACGCTCAAGTTCAAGGC‑3’，B2：5’‑GCATTGTTCCTCTCCTCATC‑3’；用于检测鸡新城疫病毒的引物对的核苷酸序列如下所示：N1：5’‑CTCATCTCAGACAGGGTCAATC‑3’，N2：5’‑ATGGAGTCACCAAGGGG‑3’；用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的引物对的核苷酸序列如下所示：L1：5’‑GCAGCGAAAAGAAGGC‑3’，L2：5’‑TCATCGTGCTCGGTGTCC‑3’；用于检测鸡毒支原体的引物对的核苷酸序列如下所示：G1：5’‑CTTACAGATTACAGGAGCAG‑3’，G2：5’‑AAGCATTTCATTTGTTTTAC‑3’；用于检测鸡滑液囊支原体的引物对的核苷酸序列如下所示：S1：5’‑ATTAGCAGCTAGTGCAGTGG‑3’，S2：5’‑TTTGAGGATTATCAGTATTTG‑3’；引物A1、B1、N1、L1、G1和S1的5’端还通过间隔臂序列添加有tag序列；引物A1、B1、N1、L1、G1和S1的5’端的tag序列分别为：引物A1的tag序列为：5’‑TACTACTTCTATAACTCACTTAAA‑3’；引物B1的tag序列为：5’‑ATTAAACAACTCTTAACTACACAA‑3’；引物N1的tag序列为：5’‑ACTTATTTCTTCACTACTATATCA‑3’；引物L1的tag序列为：5’‑ATCTCAATTACAATAACACACAAA‑3’；引物G1的tag序列为：5’‑CACTACACATTTATCATAACAAAT‑3’；引物S1的tag序列为：5’‑CTTTCTTAATACATTACAACATAC‑3’。