[发明专利]一种利用一步法实时荧光定量RT-qPCR检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒

摘要

本发明公开了一种利用一步法实时荧光定量RT‑qPCR检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，包括病毒核酸提取试剂，含检测靶多核苷酸和内对照的探针及用于扩增靶多核苷酸引物的RT‑qPCR反应缓冲液，含热启动DNA聚合酶、Revert Aid^TM M‑MLV反转录酶及RiboLock^TM核糖核酸酶抑制剂的RT‑PCR酶混合物，含假病毒颗粒的定量标准参考品；其中本发明公开的全新丙型肝炎病毒靶序列探针和引物创新性地避开了丙型肝炎病毒5’‑UTR区容易引发降解的二级结构和内切酶位点，实现了即使在病毒核酸不稳定的情况下，依然能最大限度地反映出其原始病毒载量，对样本采集、运输、保存、处理不当样本中丙型肝炎病毒核酸RNA可以检出全部的六个基因型，为丙型肝炎病毒感染的辅助诊断和其感染者药物治疗监测提供了准确依据。

主权项

1.一种利用一步法实时荧光定量RT‑qPCR检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，包括病毒核酸提取试剂，含检测靶多核苷酸和内对照的探针及用于扩增靶多核苷酸引物的RT‑qPCR反应缓冲液，含热启动DNA聚合酶、Revert Aid^TMM‑MLV反转录酶及RiboLock^TM核糖核酸酶抑制剂的RT‑PCR酶混合物，含假病毒颗粒的定量标准参考品；其特征在于：所述病毒核酸提取试剂由RNA提取溶液I、RNA提取溶液II和RNA提取溶液III组成；其中，RNA提取溶液I的配方为：异硫氰酸胍40～60克/100毫升，乙二胺四乙酸二钠0.74～1.49克/升，尿素0.6～1.5克/升，曲拉通X‑100 3～5毫升/100毫升，吐温‑20 4～6毫升/100毫升，将所述各组分按比例称重后加入20毫摩尔pH 7.0的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液中，终体积为20毫升，其中单独包装200～800微克/毫升的磁珠、5.6～6.2微克/毫升的核酸助沉剂(ployA)；RNA提取溶液II的配方为：盐酸胍3～5克/毫升，异丙醇3～5毫升/10毫升，将所述各组分按比例称量后加入DEPC处理超纯水中，终体积为40毫升；RNA提取溶液III的配方为：量取无水乙醇35～40毫升加入DEPC处理超纯水中使终体积为50毫升；所述RT‑qPCR反应缓冲液的配方为：10×Buffer成分：三羟甲基氨基甲烷‑盐酸(pH 8.0at 25℃)：       750毫摩尔硫酸铵：                                     200毫摩尔吐温‑20：                                    0.1％(V/V)；单独包装用于检测内对照的探针；其中：所述HCV‑P为用于靶多核苷酸检测的探针，其核苷酸序列为SEQ No.1所示的序列：CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAG；所述HCV‑F为用于扩增靶多核苷酸的上游引物，其核苷酸序列为SEQ No.2所示的序列：TAGCCGAGTAGTGTTGGGTYG；所述HCV‑R为用于扩增靶多核苷酸的下游引物，其核苷酸序列为SEQ No.3所示的序列：TGCACGGTCTACGAGACCTC；所述用于检测内对照的探针其核苷酸序列为SEQ No.5所示的序列：TCACTGACGCCCATCCGTCCTACCT；所述RT‑PCR酶混合物是按照下列比例混合各组分，然后加入体积比50％甘油混匀制成：所述含假病毒颗粒的定量标准参考品中用于全程监测反应的内对照假病毒颗粒与HCV阳性对照品仅探针结合序列不同，其核苷酸序列为SEQ No.4所示的序列：CGAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTATCACTGACGCCCATCCGTCCTACCTCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCATC。