[发明专利]一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法

摘要

本发明公开了一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：包括，构建重组质粒，获得重组大肠杆菌，配制培养基，制备种子液，发酵。与前期已报道的生物法合成乙醇酸相比，本发明中所提到的乙醇酸发酵技术方案在没有敲除大肠杆菌BL21(DE3)中任何基因的情况下提高了乙醇酸的产量及产率。以葡萄糖为唯一碳源，GL1、GL3、GL2摇瓶发酵产率分别为0.109g/g，0.155g/g，0.248g/g，通过发酵条件优化，GL2上罐发酵时产量达到4.275g/L，产率为0.427g/g。

主权项

1.一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：包括，/n利用基因组提取试剂盒提取大肠杆菌DH5α基因组，并以此为模板进行PCR扩增目的基因；/nNdeI和XhoI37℃双酶切PCR扩增的基因片段ycdW 两小时，PCR产物纯化试剂盒纯化，NdeI和XhoI37℃双酶切质粒pCOLADuet-1两小时，利用胶回收试剂盒回收载体片段；/nT4连接酶处理目的基因片段与载体片段，16℃处理8小时，将上述连接反应液加入100ul JM109转化 感受态中冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mL SOC液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布50ug/mL卡那抗性平板，37℃培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证，并将疑似正确菌落转接LB液体培养基，培养12~16h，利用质粒小提试剂盒提取质粒，用NdeI和XhoI酶切验证，获得pCOLADuet-1-ycdW，目的基因aceAK、启动子ptet、终止子片段的获得及与载体的连接，以大肠杆菌DH5α基因组为模板进行PCR扩增目的基因aceAK，以pGLY-2为模板进行PCR扩增启动子ptet及终止子片段，PCR产物纯化试剂盒纯化，用NcoI和PfoI 37℃双酶切pCOLADuet-1-ycdW两小时，利用胶回收试剂盒回收载体片段；/n利用Gibson组装体系构建重组质粒pJNU-2；/n取重组质粒pJNU-2 10ul，加入到100ul的BL21(DE3)化转感受态中，混合均匀，冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mL SOC液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布50ug/mL卡那抗性平板，37℃培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证，并将验证正确的重组大肠杆菌接种于含有50ug/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，摇瓶培养过夜，用15％的甘油冷冻保藏；/n甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250r/min摇瓶过夜，次日取500ul菌液转接于60ml LB液体培养基中，37℃、250r/min培养至OD600达到0.5-0.6时，接种于5L发酵罐中；发酵条件为：2％接种量，37℃培养至OD600为0.8左右时加250ng/ml aTc、1mM IPTG30℃诱导，搅拌转速400r/min，通气量1vvm，2M NaOH 维持pH为6.8～7.2；培养基配方为：M9盐溶液、8g/L葡萄糖、2mM MgSO