[发明专利]一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法

摘要

本发明涉及一种微生物酶转化法生产L‑4‑羟基异亮氨酸的方法,包括以下步骤：1、培养成熟的菌种；2、将成熟的可诱导生产L‑4‑羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入发酵罐中，进行发酵培养，发酵过程温度两阶控制，前期温度4‑36℃，后期30‑32℃；3、发酵后收集菌体，加入磷酸盐缓冲液洗涤，再加入a‑酮戊二酸、异亮氨酸、硫酸亚铁、硫酸镁、抗坏血酸，强制通风催化；4、催化液先经过陶瓷膜除菌，超滤膜，活性炭脱色，弱酸性阳离子交换树脂除盐后，流出液上732阳离子交换树脂吸附并用氨水洗脱，蒸发浓缩、重结晶，得到L‑4‑羟基异亮氨酸。本发明制备方法的反应体系简单高效且提取流程简便易行，转化率高达95.4%以上，且产品纯度可达98%以上。

主权项

一种微生物酶转化法生产L‑4‑羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）、将可诱导生产L‑4‑羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入装有种子罐培养基的种子罐中，在温度33℃‑37℃，ph 6.5‑7.5，溶氧控制在25%以上的条件下培养至菌液的OD600值为12‑16：得到成熟的可诱导生产L‑4‑羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌；所述可诱导生产L‑4‑羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌的构建方法为，克隆出其基因序列如SEQ NO.1所示的基因；将该基因构建入质粒pET28a，得到重组质粒，将重组质粒后导入大肠杆菌BL21，即得到可诱导生产L‑4‑羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌；（2）、将成熟的可诱导生产L‑4‑羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入装有发酵罐培养基的发酵罐中，进行液体深层通风发酵培养；培养过程中，培养5h时向发酵培养基中一次性投入终浓度为0.1‑0.3mmol/L的IPTG进行诱导，溶氧控制在30‑50%，pH6.5‑7.0，底糖耗尽后，流加质量浓度为10‑80%的甘油水溶液做为碳源，发酵过程温度两阶控制，加入IPTG诱导前控制温度在34‑36℃，待进行诱导表达后，调整温度到30‑32℃进行培养；（3）、发酵结束后，通过蝶式离心机低温收集菌体，并使用磷酸盐缓冲液对菌体进行洗涤，除去菌体表面杂质，然后以纯水配制催化体系：a‑酮戊二酸 30‑35g/L、异亮氨酸 26‑30g/L、硫酸亚铁0.5‑4g/L、硫酸镁0.1‑1g/L 、抗坏血酸0.01‑0.2g/L，向催化体系内加入洗涤后的菌体，强制通风催化，维持pH为6.0‑6.5，催化温度为28‑32℃，得到催化液；所述菌体的加入量为：每100ml催化体系加入0.3g菌体；（4）、催化液先经过陶瓷膜过滤除菌，再过2‑4Kd分子量的超滤膜，并经活性炭脱色，采用122弱酸性阳离子交换树脂除盐后，流出液上732阳离子交换树脂吸附并用氨水洗脱，蒸发浓缩得到L‑4‑羟基异亮氨酸粗品，然后重结晶得到L‑4‑羟基异亮氨酸。