[发明专利]一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法

权利要求书

1.一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）、将可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入装有种子罐培养基的种 子罐中，在温度33℃-37℃，ph6.5-7.5，溶氧控制在25%以上的条件下培养至菌液的OD600 值为12-16：得到成熟的可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌；

所述可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌的构建方法为，克隆出其基因序 列如SEQNO.1所示的基因；将该基因构建入质粒pET28a，得到重组质粒，将重组质粒后导入 大肠杆菌BL21，即得到可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌；

（2）、将成熟的可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入装有发酵罐培养 基的发酵罐中，进行液体深层通风发酵培养；培养过程中，培养5h时向发酵培养基中一次性 投入终浓度为0.1-0.3mmol/L的IPTG进行诱导，溶氧控制在30-50%，pH6.5-7.0，底糖耗尽 后，流加质量浓度为10-80%的甘油水溶液做为碳源，发酵过程温度两阶控制，加入IPTG诱导 前控制温度在34-36℃，待进行诱导表达后，调整温度到30-32℃进行培养；

（3）、发酵结束后，通过蝶式离心机低温收集菌体，并使用磷酸盐缓冲液对菌体进行洗 涤，除去菌体表面杂质，然后以纯水配制催化体系：a-酮戊二酸30-35g/L、异亮氨酸26- 30g/L、硫酸亚铁0.5-4g/L、硫酸镁0.1-1g/L、抗坏血酸0.01-0.2g/L，向催化体系内加入洗 涤后的菌体，强制通风催化，维持pH为6.0-6.5，催化温度为28-32℃，得到催化液；所述菌体 的加入量为：每100ml催化体系加入0.3g菌体；

（4）、催化液先经过陶瓷膜过滤除菌，再过2-4Kd分子量的超滤膜，并经活性炭脱色，采 用122弱酸性阳离子交换树脂除盐后，流出液上732阳离子交换树脂吸附并用氨水洗脱，蒸 发浓缩得到L-4-羟基异亮氨酸粗品，然后重结晶得到L-4-羟基异亮氨酸。

2.如权利要求1所述微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：所述 种子罐培养基的配方为：葡萄糖0.5-20g/L，酵母粉0.5-10g/L，蛋白胨0.5-5g/L，硫酸铵 0.5-10g/L，磷酸二氢钾0.5-3g/L，硫酸镁0.5-3g/L，维生素B10-20mg/L，维生素H0.5- 10mg/L，硫酸亚铁0.5-50mg/L，硫酸锰0.5-50mg/L，消泡剂0-0.5ml/L，其余为水。

3.如权利要求1所述微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：所述 发酵罐培养基的配方为：葡萄糖0.5-10g/L，酵母粉0.5-10g/L，蛋白胨0.5-5g/L，硫酸铵 0.5-10g/L，磷酸二氢钾0.5-3g/L，硫酸镁0.5-3g/L，VB10.5-20mg/L，VH0.5-10mg/L，硫酸 亚铁0.5-50mg/L，硫酸锰0.5-50mg/L，玉米浆0.5-10mL，柠檬酸钠0.5-2g/L和消泡剂0- 0.5ml/L，其余为水。

4.如权利要求1所述微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：所述 步骤（4）中催化液在经过陶瓷膜过滤除菌前先加热至60-80℃，并保持10-40min。

5.如权利要求1所述微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：所述 步骤（4）中活性炭脱色时加炭量为料液体积的0.1-5%，保温时间为30-60min。

6.如权利要求1所述微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：所述 步骤（4）中洗脱用的氨水质量浓度为1-3%，洗脱流速为1-1.5BV/h。

7.如权利要求1所述微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：步骤 （4）中所述蒸发浓缩，蒸发浓缩后4-羟基异亮氨酸粗品的终浓度为500-600g/L。