[发明专利]一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异 亮氨酸的方法。

背景技术

L-4-羟基异亮氨酸（4-hydroxyisoleucine）是一种自然界存在的非蛋白质氨基 酸。研究发现，L-4-羟基异亮氨酸具有促进胰岛素分泌、提高胰岛素耐受和调节血脂等多方 面作用。L-4-羟基异亮氨酸不仅能够促进周围组织对葡萄糖的摄取利用，还能够减少肝脏 葡萄糖输出以提高外周组织的胰岛素耐受。相比现在已经用于治疗T2DM的药物，L-4-羟基 异亮氨酸调控的胰岛素合成是严格依赖葡萄糖浓度。因此，L-4-羟基异亮氨酸不会引起类 似低血糖等副作用。同时还发现L-4-羟基异亮氨酸能有效降低血液中甘油三酯和胆固醇的 量，具有加速脂肪代谢、降血脂和保护肝功能的作用。因此，作为有效预防和治疗糖尿病及 肥胖症的理想药物，L-4-羟基异亮氨酸具有广泛的应用前景和市场需求。

受技术和成本的限制，我国L-4-羟基异亮氨酸的产量不能满足国内和外贸出口的 需求。目前报道的L-4-羟基异亮氨酸生产方法包括提取法、化学合成法以及酶法，但仅提取 法用于工业化生产且存在提取率低、分离纯化困难、原材料需求量大和成本高等不足，传统 的化学法不论是有机合成或化学拆分均因生产成本高而失去竞争力。生物方法中因酶催化 方法制备方法效率相对较高，但仍存在操作繁琐，原料昂贵，生产成本过高的问题，而目前 缺乏相关可用于工业化大规模生产的工艺技术。

发明内容

本发明的目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种微生物酶转化法生产L-4- 羟基异亮氨酸的方法，采用高密度发酵且酶活高，反应体系简单高效且提取流程简便易行， 收率可达75%且产品纯度在98%以上，该方法效率高，成本低，易于产业化生产。

本发明为解决上述技术问题，所提供的技术方案是：一种微生物酶转化法生产L- 4-羟基异亮氨酸的方法，包括以下步骤：

（1）、将可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入装有种子罐培养基的种 子罐中，在温度33℃-37℃，ph6.5-7.5，溶氧控制在25%以上的条件下培养至菌液的OD600 值为12-16：得到成熟的可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌；

所述可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌的构建方法为：根据苏云金芽孢 杆菌YL-03中基因IDO（即编码L-异亮氨酸羟化酶的基因）对其进行人工修饰，获得基因序列 如SEQNO.1所示；克隆出该基因，并将该基因构建入质粒pET28a，得到重组质粒，将重组质 粒后导入大肠杆菌BL21，即得到可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌。

（2）、将成熟的可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入装有发酵罐 培养基的发酵罐中，进行液体深层通风发酵培养；培养过程中，培养5h时向发酵培养基中一 次性投入终浓度为0.1-0.3mmol/L的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）进行诱导，溶氧控制 在30-50%，pH6.5-7.0，底糖耗尽后，流加质量浓度为10-80%的甘油水溶液做为碳源，发酵过 程温度两阶控制，加入IPTG诱导前控制温度在34-36℃，待进行诱导表达后，调整温度到30- 32℃进行培养；

（3）、发酵结束后，通过蝶式离心机低温收集菌体，并使用磷酸盐缓冲液对菌体进行洗 涤，除去菌体表面杂质，然后以纯水配制催化体系：a-酮戊二酸30-35g/L、异亮氨酸26- 30g/L、硫酸亚铁0.5-4g/L、硫酸镁0.1-1g/L、抗坏血酸0.01-0.2g/L，向催化体系内加入洗 涤后的菌体，强制通风催化，维持pH为6.0-6.5，催化温度为28-32℃，得到催化液；所述菌体 的加入量为：每100ml催化体系加入0.3g菌体；

（4）、催化液先经过陶瓷膜过滤除菌，再过2-4Kd分子量的超滤膜，并经活性炭脱色，采 用122弱酸性阳离子交换树脂除盐后，流出液上732阳离子交换树脂吸附并用氨水洗脱，蒸 发浓缩得到L-4-羟基异亮氨酸粗品，然后重结晶得到L-4-羟基异亮氨酸。