[发明专利]一种激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法

摘要

本发明公开了一种激活Nrf2‑ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法。本发明以双髻鲨鱼肉为原料，通过双酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化肽Ile‑Ile‑Gly‑Leu‑Val‑Pro(IIGLVP)，ESI‑MS测定分子量为610.77 Da；制备的高活性抗氧化肽对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时亦可促进Nrf2蛋白质积累，激活Nrf2‑ARE通路，可用作治疗肝损伤、皮肤光老化、动脉硬化、中风、糖尿病和肥胖等与Nrf2‑ARE通路密切相关疾病治疗的药物和功能产品。

主权项

一种具有激活Nrf2‑ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）双髻鲨鱼肉的预处理：取双髻鲨鱼肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至90~95 ℃后保温5~10min，然后按照料液比1g:2~4mL加入异丙醇，于25～30℃、功率450～500 W超声提取2～3 h，然后于4℃、9000~10000 rpm离心10~15min除去异丙醇，收集脱脂双髻鲨鱼肉固形物；2）脱脂双髻鲨鱼肉固形物的酶解：取脱脂双髻鲨鱼肉固形物，按固液比1 g:10mL～15 mL加入甘氨酸—氢氧化钠缓冲液，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH调节pH到9.0～10.0，得混合液；将混合物温度调制55～65℃，按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.2 %～1.5 %加入碱性蛋白酶，酶解时间2 h～2.5 h后，酶解液于90～95℃保温10～15min，灭酶活；将酶解液温度调至35~45℃，按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.0 %～1.2%加入胰蛋白酶，酶解时间3 h～4 h，酶解液于90～95℃保温10～15min后降至室温，于10000～12000 rpm离心10～15 min，取上清液；3）双髻鲨鱼肉抗氧化肽的分离制备：将上述上清液依次经超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得双髻鲨鱼肉抗氧化肽；其中，所述步骤2）中的甘氨酸—氢氧化钠缓冲液含0.05mol/L，pH值为9.5；碱性蛋白酶的酶活力≥1.95×10⁵ U/g；胰蛋白酶的酶活力≥2.5×10⁴ U/g。