[发明专利]一种激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法

权利要求书

1.一种具有激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）双髻鲨鱼肉的预处理：取双髻鲨鱼肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至90~95℃后保温5~10min，然后按照料液比1g:2~4mL加入异丙醇，于25～30℃、功率450～500W超声提取2～3h，然后于4℃、9000~10000rpm离心10~15min除去异丙醇，收集脱脂双髻鲨鱼肉固形物；2）脱脂双髻鲨鱼肉固形物的酶解：取脱脂双髻鲨鱼肉固形物，按固液1g:10mL～15mL加入甘氨酸—氢氧化钠缓冲液，用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH调节pH到9.0～10.0，得混合液；将混合物温度调制55～65℃，按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.2%～1.5%加入碱性蛋白酶，酶解时间2h～2.5h后，酶解液于90～95℃保温10～15min，灭酶活；将酶解液温度调至35~45℃，按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.0%～1.2%加入胰蛋白酶，酶解时间3h～4h，酶解液于90～95℃保温10～15min后降至室温，于10000～12000rpm离心10～15min，取上清液；3）双髻鲨鱼肉抗氧化肽的分离制备：将上述上清液依次经超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得双髻鲨鱼肉抗氧化肽；其中，所述步骤2）中的甘氨酸—氢氧化钠缓冲液浓度为0.05mol/L，pH值为9.5；碱性蛋白酶的酶活力≥1.95×10⁵U/g；胰蛋白酶的酶活力≥2.5×10⁴U/g；所述步骤3）的超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：超滤：将上述酶解上清液采用1kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1kDa部分，得超滤酶解液；大孔树脂精制：将超滤酶解液配成15～20mg/mL的溶液，缓慢加入到超滤酶解液与D101大孔树脂比为1:10～15的玻璃柱中，用3～5倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，再用3～4倍柱体积的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱物，喷雾干燥，即为大孔树脂精制多肽；凝胶柱层析：将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为20～30mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.8～1.2mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于220nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为凝胶层析酶解物；反相高效液相色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90～100μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，所述反相高效液相色谱条件为：进样量15～20μL；色谱柱规格为250mm×4.6mm，填料直径为5μm的Zorbax SB-C₁₈；流动相为水-乙腈梯度洗脱，0～45min乙腈浓度，由0匀速升至45%；洗脱速度0.8~1.0mL/min；紫外检测波长220nm，根据对羟基自由基的清除活性得1个高抗氧化活性多肽Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro，ESI-MS测定分子量为610.77Da。