[发明专利]一种激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法

说明书

本发明公开了一种激活Nrf2‑ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法。本发明以双髻鲨鱼肉为原料，通过双酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化肽Ile‑Ile‑Gly‑Leu‑Val‑Pro(IIGLVP)，ESI‑MS测定分子量为610.77 Da；制备的高活性抗氧化肽对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时亦可促进Nrf2蛋白质积累，激活Nrf2‑ARE通路，可用作治疗肝损伤、皮肤光老化、动脉硬化、中风、糖尿病和肥胖等与Nrf2‑ARE通路密切相关疾病治疗的药物和功能产品。

技术领域

本发明涉及一种抗氧化活性肽的制备方法，具体涉及一种激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法 。

背景技术

鲨鱼全身是宝，有的种类肉质鲜美，是餐桌上常见的菜肴。鱼皮具有良好的韧性，是皮革加工业的原料。现代医学证明鲨鱼软骨也具有很大的药用价值，1992年美国首先将鲨鱼软骨粉直接用于临床治疗肿瘤。

双髻鲨（Sphyrna lewini）为软骨鱼纲，真鲨目，双髻鲨科，在我国主要分布于黄海、东海和南海。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种具有激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法，其包括以下步骤：

1）双髻鲨鱼肉的预处理：取双髻鲨鱼肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至90~95 ℃后保温5~10min，然后按照料液比1g:2~4mL加入异丙醇，于25～30℃、功率450～500 W超声提取2～3 h，然后于4℃、9000~10000 rpm离心10~15min除去异丙醇，收集脱脂双髻鲨鱼肉固形物；

2）脱脂双髻鲨鱼肉固形物的酶解：取脱脂双髻鲨鱼肉固形物，按固液比1 g:10mL～15 mL加入甘氨酸—氢氧化钠缓冲液（0.05mol/L，pH 9.5），用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH调节pH到9.0～10.0，得混合液；将混合物温度调制55～65℃，按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.2 %～1.5 %加入碱性蛋白酶（酶活力≥1.95×10⁵ U/g），酶解时间2 h～2.5 h后，酶解液于90～95℃保温10～15min，灭酶活；将酶解液温度调至35~45℃，按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.0 %～1.2%加入胰蛋白酶（酶活力≥2.5×10⁴ U/g），酶解时间3h～4 h，酶解液于90～95℃保温10～15min后降至室温，于10000～12000 rpm离心10～15min，取上清液。

3）双髻鲨鱼肉抗氧化肽的分离制备：将上述上清液依次经超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化，得双髻鲨鱼肉抗氧化肽。

作为优选，所述步骤3）的超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：

超滤：将上述酶解上清液采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解液。

大孔树脂精制：将超滤酶解液配成15～20 mg/mL的溶液，缓慢加入到超滤酶解液与D101大孔树脂比为1:10～15的玻璃柱中，用3～5倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，再用3～4倍柱体积的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱物，喷雾干燥，即为大孔树脂精制多肽。