[发明专利]一株高效分泌D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的基因工程菌株、构建方法及其应用

摘要

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株高效分泌D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的基因工程菌株及其构建方法。本发明首先获得了来源于瘤胃菌Ruminococcus sp.5_1_39B_FAA的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶基因rdpe，构建重组表达质粒pMA5‑RDPE并转化枯草芽孢杆菌，实现了RDPE在枯草芽孢杆菌中组成型分泌表达。通过比较三个糖诱导型启动子，得到最优诱导型启动子P_xylA，并明显提高了RDPE的分泌水平。通过敲除木糖利用基因xylAB(xylA和xylB)，阻断了枯草芽孢杆菌的木糖代谢途径，进一步提高了RDPE的分泌量，并使诱导剂木糖的最优诱导浓度由4.0%降低为0.5%。最终，采用分批补料方式，在7.5 L发酵罐中对工程菌株1A751SD‑XR进行评价，RDPE的分泌水平最高可以达到95 U/mL和2.6 g/L。

主权项

1.一种高效分泌表达D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株1A751SD‑XR，该菌株通过在出发菌株1A751‑amyE::P_araR‑spe中敲除染色体上的xylAB操纵子，并转入pMA5‑P_xylA‑RDPE质粒获得，其具体步骤为：(1)PCR扩增或化学合成rdpe基因序列，rdpe基因为瘤胃菌D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶基因，其序列如SEQ ID NO.1所示；(2)将rdpe基因插入表达质粒pMA5，构建重组表达质粒pMA5‑RDPE；(3)以诱导型启动子P_xylA替换pMA5‑RDPE上的组成型启动子P_HpaII，构建重组表达质粒pMA5‑P_xylA‑RDPE；(4)在amyE被P_araR‑spe替换的枯草芽孢杆菌1A751，即1A751S的染色体上进一步敲除xylAB操纵子基因，得到宿主枯草芽孢杆菌1A751SD；(5)在1A751SD中导入重组表达质粒pMA5‑P_xylA‑RDPE，从而获得基因工程菌株1A751SD‑XR。