[发明专利]一株高效分泌D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的基因工程菌株、构建方法及其应用

权利要求书

1.一种高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株1A751SD-XR，该菌株通过在出发菌株1A751-amyE::P_araR-spe中敲除染色体上的xylAB操纵子，并转入pMA5-P_xylA-RDPE质粒获得，其具体步骤为：

(1)PCR扩增或化学合成rdpe基因序列，rdpe基因为瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因，其序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将rdpe基因插入表达质粒pMA5，构建重组表达质粒pMA5-RDPE；

(3)以诱导型启动子P_xylA替换pMA5-RDPE上的组成型启动子P_HpaII，构建重组表达质粒pMA5-P_xylA-RDPE；

(4)在amyE被P_araR-spe替换的枯草芽孢杆菌1A751，即1A751S的染色体上进一步敲除xylAB操纵子基因，得到宿主枯草芽孢杆菌1A751SD；

(5)在1A751SD中导入重组表达质粒pMA5-P_xylA-RDPE，从而获得基因工程菌株1A751SD-XR。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌株1A751SD-XR，其特征在于：1A751SD-XR菌株为xylAB操纵子基因缺陷型菌株，其所含质粒上含有木糖诱导启动子P_xylA。

3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌株1A751SD-XR在分泌生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，主要包括以下步骤：将基因工程菌株1A751SD-XR用种子培养基活化后，将种子液以0.5％～5％接种量转入装液量50％～70％的发酵罐中，通气量1.0～2.0vvm，搅拌转速100～800rpm，pH不作控制，于37℃培养；待发酵液OD₆₀₀稳定后以恒定流速进行补料；发酵培养基成分为2.0％～4.0％蛋白胨、3.0％～7.0％酵母提取物、0.3％～0.9％磷酸氢二钾和1.0％～3.0％可溶性淀粉，初始pH7.2；补料培养基为2.0％～8.0％可溶性淀粉；当基因工程菌株需诱导表达时，待发酵液OD₆₀₀达到0.8时添加一定浓度的诱导物木糖。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将基因工程菌株1A751SD-XR用种子培养基活化后，将种子液以1.0％接种量转入装液量60％的发酵罐中，通气量2.0vvm，搅拌转速200～600rpm，pH控制在7.2，于37℃培养；发酵培养基成分为3.0％蛋白胨、5.0％酵母提取物、0.6％磷酸氢二钾和2.0％可溶性淀粉，初始pH7.2；补料培养基为8.0％可溶性淀粉；当基因工程菌株需诱导表达时，待发酵液OD₆₀₀达到0.8时添加一定浓度的诱导物木糖。