[发明专利]进行抗体表达和组装的重组系统及应用

摘要

本发明属于分子生物学和蛋白质技术领域，具体涉及抗体表达和组装的重组系统及应用，公开一种表达抗体重链和轻链的真核表达载体，其目的是提供一种重组真核表达载体及其构建方法，便于表达各类抗体。本发明还公开了pRTL1‑HC和pRTL1‑LC的上述真核表达载体的应用。本发明是以表达IgG抗体重链和轻链的真核表达载体为基础，进一步能够表达包括IgG抗体、Fab抗体、Fv抗体、人源化ScFv‑Fc抗体以及鼠/人嵌合抗体等各类不同功能的抗体，有助于提高抗体表达Fv、Fab及ScFv等片段的表达效率，为能够成功表达各种不同功能的抗体提供重要的参考。

主权项

一种进行抗体表达和组装的重组系统，其特征在于，所述重组系统包括宿主细胞和重组载体；所述宿主细胞为CHO细胞或293F细胞；所述重组载体包括重链区域表达载体pRTL1‑HC和轻链区域表达载体pRTL1‑LC，重组载体的载体骨架为pRTL载体；所述重组载体的构建方法如下：（1）pRTL1‑HC改造设计a. 将含有Fd区域的pFabZip1克隆载体GenBank：AY190524中2364bp到2666bp的序列，与pFUSE‑hFc2‑adapt‑ScFv载体GenBank：FJ716123上的CH1、CH2、CH3恒定区序列融合得到融合片段Fd‑CH1‑CH2‑CH3；在融合片段的Fd端上加EoRI酶切位点，CH3端上加NheI酶切位点，人工合成该部分元件序列如SEQ ID NO：13所示；b. 如SEQ ID NO：13所示的元件序列和改造载体pFUSE‑hFc2‑adapt‑ScFv分别经EcoRI和NheI双酶切后连接，完成表达完整的具有铰链区的IgG重链质粒的构建，命名为pRTL载体；c. 以抗HER2抗体的VH序列为模板，从EcoRI处设计正向引物a如SEQ ID NO：5所示，再设计反向引物b如SEQ ID NO：6所示，扩增VH序列；正向引物c如SEQ ID NO：7所示，CH3尾加XbaI切点设计的反向引物d如SEQ ID NO：8所示，一同扩增Fd‑CH1‑CH2‑CH3融合序列；通过重叠延伸PCR将VH和Fd‑CH1‑CH2‑CH3进行融合得VH‑Fd‑CH1‑CH2‑CH3；d. 用T4 DNA连接酶连接经EcoRI和XbaI双酶切的VH‑Fd‑CH1‑CH2‑CH3融合产物和经EcoRI和NheI双酶切的pRTL载体，其中XbaI和NheI为同尾酶，经连接后，这两个酶切位点消失，得到pRTL1‑HC载体；（2）pRTL1‑LC改造设计a. 将pMThIgG1‑V表达载体GenBank：AM408495中562bp到885bp的CL区域序列如SEQ ID NO：14所示，通过人工合成得到具有EcoRI、BsiWI和NheI酶切位点的CL区域片段；b. 将人工合成的CL区域序列经EcoRI和NheI双酶切后连接到经同样EcoRI和NheI双酶切的pFUSE‑hFc2‑adapt‑ScFv骨架载体上，完成表达抗体轻链的质粒的构建，命名为pRTL’载体；c. 以抗HER2抗体的VL序列为模板，从EcoRI处设计正向引物e序列如SEQ ID NO：9所示，从CL的端BsiWI酶切位点序列处设计反向引物f如SEQ ID NO：10所示和正向引物g如SEQ ID NO：11所示，从NheI处设计反向引物h如SEQ ID NO：12所示，PCR扩增VL序列；d. 用T4 DNA连接酶连接经EcoRI和BsiWI双酶切的步骤c中纯化的PCR产物和pRTL’载体，得到pRTL1‑LC载体；（3）以pRTL1‑HC和pRTL1‑LC重组载体共转染宿主细胞，表达完整的IgG抗体；所述重链区域表达载体用EcoRI和NheI双酶切并与所需的VH连接，转化获得质粒，转染真核细胞即可表达不同抗体的IgG重链；所述轻链区域表达载体用EcoRI和BsiWI双酶切并与所需的VL连接，转化获得质粒，转染真核细胞表达不同抗体的轻链；所述重组系统在共转染宿主细胞后表达抗体；所述pRTL载体骨架包含启动子和信号肽，启动子为两种复合启动子，选自hFerL、hEF1‑HTLV、u6、H1、GAP或CaMV，信号肽选自外源蛋白自身的天然信号肽、IL2、Igkappa或hGHRH。