[发明专利]进行抗体表达和组装的重组系统及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和蛋白质技术领域，具体涉及抗体表达和组装的重组系统及应用。

技术背景

自抗体研究以来，许多棘手的临床疾病对于医生来说并非不可能。随着技术的不断发展，抗体的研究也有了突飞猛进的进步。抗体的研究也进入新阶段，从最初简单的抗体到鼠源化抗体，再到如今的人源化抗体。如今人源化抗体的不断进步和完善，在医学领域得到了广泛应用，在医学领域的应用已显示出它巨大的潜力。

人源化抗体是在嵌合抗体的基础上减少鼠源成分，保留鼠抗体CDR区，其余全部替换成人抗体相应部分，经过改型抗体，人源成分达90％即为所指的人源化抗体。在疾病治疗中，人源化抗体优于鼠源化抗体，不仅因为抗体中鼠源性成分的减少降低了机体的免疫排斥反应，还在于人源化抗体中Fc段，能够诱发机体的效应机能募集效应因子或效应细胞，后者对靶细胞具有杀伤作用。还有一个优点在于人源化抗体在体内的半衰期可达数天，而鼠源抗体的半衰期则不到20h。

随着抗体工程的发展，建立在噬菌体外壳表达抗体片段的能力基础上的噬菌体展示技术产生，即从免疫后的脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA，利用PCR技术分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体上，并在适当的宿主细胞中表达成有功能的抗体分子，从而利用抗原-抗体特异性结合进行筛选、扩增，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。

近几年来，随着对鼠单克隆抗体的人源化技术越来越成熟，大量的人源化抗体被用于临床治疗肿瘤疾病研究，它已成为继手术切除、放疗及化疗后又一治疗肿瘤的药物。因此研究有利于表达人源化抗体的载体骨架也变的至关重要。

以pRTL骨架为基础的表达人源化抗体的真核载体已有一些研究，pRTL质粒的特点：

hEF1-HTLV启动子是一个含有延伸因子-1α(EF-1α)核心启动子和人类T细胞白血病病毒(HTLV)I型长末端重复区域的R片段和R-U5，序列的复合启动子。在体外转基因研究中EF-1α启动子展示出很强的活性，并启动产生持久的表达。R-U5，和EF-1α一同以提高RNA的稳定性。

SV40pAn：猿猴病毒40晚期多聚腺苷酸化信号促使有效的分割和聚腺苷酸化反应，导致大量稳定态mRNA的产生。

Ori：一个最短的E.coli复制起点，它可用来控制载体的大小，但是与长的Ori具有相同的活性。

CMV enhancor/hFerLpromter:这种复合启动子由人类巨细胞病毒immediate-early基因1增强子和人类铁蛋白轻链基因的核心启动子所组成。这个普遍存在的启动子引导Zeocin^TM抗性基因在哺乳动物细胞中的表达。

EM2KC：是一个细菌启动子，它能够使抗性基因在E.coli细胞内中持续表达。EM2KC位于内含子内，是在哺乳动物细胞中被剪切掉。

βGlopAn:人beta-globin 3，UTR和多腺苷酸化序列能够让转基因转录得到有效捕获。

Human IgHG1(IgG1重链恒定区)：当将重链可变区插入到多克隆位点时，务必注意读码框的正确，以保证重链恒定区的完整。

Zeocin：抗Zeocin抗性序列是来源于Streptoalloteichushindustanus的Shble基因。这个基因可用于哺乳动物和原核生物如E.coli的抗性选择。这种抗生素可用来分离对其它筛选剂(如：庆大霉素，潮霉素)有抗性的克隆。Zeocin是一种属于争光霉素家族的糖蛋白抗生素，在体内能作用于大多数细菌(包括E.coli)、真菌(如：酵母菌)、植物细胞、动物细胞。

所述重组载体为一种穿梭质粒，具有两种不同复制起点，因而可以在真核和原核两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。为了提高表达效率，本载体在起始密码子侧翼加上了Kozak序列，后期在设计插入基因时不必考虑Kozak序列的引入问题。所述重组载体是真核原核细胞共用一个抗性筛选标记，为：zeocin抗性，在原核质粒制备系统中的使用浓度为25μg/ml，在真核表达系统中的筛选浓度约为500μg/ml，不同真核细胞抗性筛选浓度稍有不同。

将插入序列连接到由限制性内切酶酶切的载体后，在原核细胞中纯化质粒，共转染至相对应的真核宿主细胞(293F细胞或CHO细胞)，表达具有功能的各类抗体。

发明内容