[发明专利]进行抗体表达和组装的重组系统及应用

权利要求书

1.一种进行抗体表达和组装的重组系统，其特征在于，所述重组系统包括宿主细胞和重组载体；所述宿主细胞为CHO细胞或293F细胞；所述重组载体包括重链区域表达载体pRTL1-HC和轻链区域表达载体pRTL1-LC，重组载体的载体骨架为pRTL载体；

所述重组载体的构建方法如下：

（1）pRTL1-HC改造设计

a. 将含有Fd区域的pFabZip1克隆载体GenBank：AY190524中2364bp到2666bp的序列，与pFUSE-hFc2-adapt-ScFv载体GenBank：FJ716123上的C_H1、C_H2、C_H3恒定区序列融合得到融合片段Fd-C_H1-C_H2-C_H3；在融合片段的Fd端上加EoRI酶切位点，C_H3端上加NheI酶切位点，人工合成该部分元件序列如SEQ ID NO：13所示；

b. 如SEQ ID NO：13所示的元件序列和改造载体pFUSE-hFc2-adapt-ScFv分别经EcoRI和NheI双酶切后连接，完成表达完整的具有铰链区的IgG重链质粒的构建，命名为pRTL载体；

c. 以抗HER2抗体的V_H序列为模板，从EcoRI处设计正向引物a如SEQ ID NO：5所示，再设计反向引物b如SEQ ID NO：6所示，扩增V_H序列；正向引物c如SEQ ID NO：7所示，C_H3尾加XbaI切点设计的反向引物d如SEQ ID NO：8所示，一同扩增Fd-C_H1-C_H2-C_H3融合序列；通过重叠延伸PCR将V_H和Fd-C_H1-C_H2-C_H3进行融合得V_H-Fd-C_H1-C_H2-C_H3；

d. 用T4 DNA连接酶连接经EcoRI和XbaI双酶切的V_H-Fd-C_H1-C_H2-C_H3融合产物和经EcoRI和NheI双酶切的pRTL载体，其中XbaI和NheI为同尾酶，经连接后，这两个酶切位点消失，得到pRTL1-HC载体；

（2）pRTL1-LC改造设计

a. 将pMThIgG1-V表达载体GenBank：AM408495中562bp到885bp的C_L区域序列如SEQ ID NO：14所示，通过人工合成得到具有EcoRI、BsiWI和NheI酶切位点的C_L区域片段；

b. 将人工合成的C_L区域序列经EcoRI和NheI双酶切后连接到经同样EcoRI和NheI双酶切的pFUSE-hFc2-adapt-ScFv骨架载体上，完成表达抗体轻链的质粒的构建，命名为pRTL’载体；

c. 以抗HER2抗体的V_L序列为模板，从EcoRI处设计正向引物e序列如SEQ ID NO：9所示，从C_L的端BsiWI酶切位点序列处设计反向引物f如SEQ ID NO：10所示和正向引物g如SEQ ID NO：11所示，从NheI处设计反向引物h如SEQ ID NO：12所示，PCR扩增V_L序列；

d. 用T4 DNA连接酶连接经EcoRI和BsiWI双酶切的步骤c中纯化的PCR产物和pRTL’载体，得到pRTL1-LC载体；

（3）以pRTL1-HC和pRTL1-LC重组载体共转染宿主细胞，表达完整的IgG抗体；

所述重链区域表达载体用EcoRI和NheI双酶切并与所需的VH连接，转化获得质粒，转染真核细胞即可表达不同抗体的IgG重链；所述轻链区域表达载体用EcoRI和BsiWI双酶切并与所需的VL连接，转化获得质粒，转染真核细胞表达不同抗体的轻链；所述重组系统在共转染宿主细胞后表达抗体；

所述pRTL载体骨架包含启动子和信号肽，启动子为两种复合启动子，选自hFerL、hEF1-HTLV、u6、H1、GAP或CaMV，信号肽选自外源蛋白自身的天然信号肽、IL2、Igkappa或hGHRH。