[发明专利]唾液外泌体的制备方法及其在分子诊断中的应用

摘要

本发明公开了一种唾液外泌体的制备方法及其在分子诊断中的应用；包括以下步骤：从唾液样品中去除高丰度蛋白，滤去黏蛋白，分离提取外泌体，对所得外泌体进行表征，提取外泌体蛋白，对蛋白进行鉴定，并应用与肺癌生物标志物的发现。目前尚没有规范化的唾液外泌体制备技术，现有制备技术存在高丰度蛋白干扰和背景杂质干扰，导致外泌体回收率低、鉴定蛋白少等不足，难以反映真实的外泌体蛋白组学信息。本发明以成人健康志愿者和肺癌患者的唾液为样本，采用亲和层析色谱和膜分离结合技术，在去除了唾液的高丰度蛋白和黏蛋白后，通过离心提取唾液中的外泌体，并对其蛋白组进行分析，鉴定到了更多的外泌体蛋白。

主权项

1.一种唾液外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、通过亲和层析色谱法去除唾液中的高丰度蛋白，结合滤膜去除黏蛋白；所述亲和层析色谱法以淀粉为固定相，以磷酸盐缓冲液为流动相，所述滤膜连接在亲和层析色谱柱后；S2、对步骤S1处理后的唾液进行冷冻离心，提取唾液外泌体及唾液外泌体蛋白；所述步骤S1具体为：以1:1的淀粉和蛋白比例制备亲和层析色谱柱的固定相，后连接5μm的PVDF膜以完成色谱和膜分离技术的一体化；首先用流动相PBS进行色谱柱的平衡和膜的活化；后在色谱进样端进唾液样本，并以800μL/min的速度，总体积为2mL的流动相PBS洗脱唾液样本；所述步骤S2中，提取唾液外泌体具体为：收集步骤S1洗脱的唾液样本在4℃，20000g离心60分钟，弃上清，保留外泌体；用磷酸盐缓冲液缓慢重悬外泌体，在4℃，20000g离心60分钟，弃上清保留外泌体；重复所述步骤S2中提取唾液外泌体的步骤2‑3次；所述步骤S2中，提取唾液外泌体蛋白具体为：取300μL唾液提取的外泌体，加入100μL磷酸盐缓冲液；再加入2μL聚乙二醇辛基苯基醚、5μL蛋白酶抑制剂cocktail冰上裂解30分钟；在4℃，20000g离心60分钟，上清即为外泌体蛋白裂解液；再加入10倍体积的冰乙醇过夜沉淀得到唾液外泌体蛋白。