[发明专利]唾液外泌体的制备方法及其在分子诊断中的应用

权利要求书

1.一种唾液外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、通过亲和层析色谱法去除唾液中的高丰度蛋白，结合滤膜去除黏蛋白；

所述亲和层析色谱法以淀粉为固定相，以磷酸盐缓冲液为流动相，所述滤膜连接在亲和层析色谱柱后；

S2、对步骤S1处理后的唾液进行冷冻离心，提取唾液外泌体及唾液外泌体蛋白；

所述步骤S1具体为：以1:1的淀粉和蛋白比例制备亲和层析色谱柱的固定相，后连接5μm的PVDF膜以完成色谱和膜分离技术的一体化；首先用流动相PBS进行色谱柱的平衡和膜的活化；后在色谱进样端进唾液样本，并以800μL/min的速度，总体积为2mL的流动相PBS洗脱唾液样本；

所述步骤S2中，提取唾液外泌体具体为：收集步骤S1洗脱的唾液样本在4℃，20000g离心60分钟，弃上清，保留外泌体；用磷酸盐缓冲液缓慢重悬外泌体，在4℃，20000g离心60分钟，弃上清保留外泌体；重复所述步骤S2中提取唾液外泌体的步骤2-3次；

所述步骤S2中，提取唾液外泌体蛋白具体为：取300μL唾液提取的外泌体，加入100μL磷酸盐缓冲液；再加入2μL聚乙二醇辛基苯基醚、5μL蛋白酶抑制剂cocktail冰上裂解30分钟；在4℃，20000g离心60分钟，上清即为外泌体蛋白裂解液；再加入10倍体积的冰乙醇过夜沉淀得到唾液外泌体蛋白。

2.根据权利要求1所述的唾液外泌体的制备方法，其特征在于，所述滤膜为1.0～5.0μm聚偏氟乙烯膜。

3.根据权利要求1所述的唾液外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S2后，还包括采用液相色谱和质谱联用技术进行外泌体蛋白种类鉴定的步骤。