[发明专利]唾液外泌体的制备方法及其在分子诊断中的应用

说明书

本发明公开了一种唾液外泌体的制备方法及其在分子诊断中的应用；包括以下步骤：从唾液样品中去除高丰度蛋白，滤去黏蛋白，分离提取外泌体，对所得外泌体进行表征，提取外泌体蛋白，对蛋白进行鉴定，并应用与肺癌生物标志物的发现。目前尚没有规范化的唾液外泌体制备技术，现有制备技术存在高丰度蛋白干扰和背景杂质干扰，导致外泌体回收率低、鉴定蛋白少等不足，难以反映真实的外泌体蛋白组学信息。本发明以成人健康志愿者和肺癌患者的唾液为样本，采用亲和层析色谱和膜分离结合技术，在去除了唾液的高丰度蛋白和黏蛋白后，通过离心提取唾液中的外泌体，并对其蛋白组进行分析，鉴定到了更多的外泌体蛋白。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种唾液外泌体的制备方法及其在分子诊断中的应用。

背景技术

外泌体(Extracellular Vesicles)是指由细胞分泌到细胞外微环境的一种具有膜结构的囊泡，是细胞在向外出芽和细胞膜裂变的过程中释放出的含有胞膜成分的微小颗粒，能携带多种特异性蛋白质、microRNA、脂质等物质。外泌体的尺寸介于0.05～1.00μm之间，近年来的癌症机理研究证实外泌体与细胞间的物质、能量、信息传递相关，特别是癌症细胞之间或癌症细胞与正常细胞之间的相互影响。外泌体广泛存在于组织和体液中，在疾病的临床诊断、预后推测、健康管理等方面具有重要的指导作用。特别是肿瘤细胞来源的外泌体，其作为肿瘤细胞与外界环境信号交流的媒介，将肿瘤细胞所特有的蛋白、mRNA和miRNA等生物活性物质传递给周围的环境和细胞，在入侵其他细胞的同时改造微环境，使其向更有利于肿瘤发展的方向转变{M.Baj-Krzyworzeka et al.，Tumour-derivedmicrovesicles carry several surface determinants and mRNA of tumour cells andtransfer some of these determinants to monocytes.Cancer ImmunologyImmunotherapy 55，808-818(2006)；K.Al-Nedawi，B.Meehan，J.Rak，MicrovesiclesMessengers and mediators of tumor progression.Cell Cycle 8，2014-2018(2009)；N.S.Barteneva，N.Maltsev，I.A.Vorobjev，Microvesicles and intercellularcommunication in the context of parasitism.Frontiers in Cellular andInfection Microbiology 3，(2013).}。因此对于外泌体的研究已经成为癌症机理研究、疾病诊断的重要组成部分{E.Colombo，B.Borgiani，C.Verderio，R.Furlan，Microvesicles：novel biomarkers for neurological disorders.Frontiers in Physiology 3，63(2012)；B.Frey，U.S.Gaipl，The immune functions ofphosphatidylserine inmembranes of dying cells and microvesicles.Seminars in Immunopathology 33，497-516(2011)；J.Conde-Vancells，E.Gonzalez，S.C.Lu，J.M.Mato，J.M.Falcon-Perez，Overview of extracellular microvesicles in drug metabolism.Expert Opinion onDrug Metabolism & Toxicology 6，543-554(2010).}。

目前对外泌体的研究还处于初级阶段，由于对其组成成分尚不完全清楚，对其生物学功能研究亟待加强。唾液作为一种含有大量生物信息的体液，其用于临床诊断优势明显，因具有在于非侵入、安全、简便等特点，在疾病的分子诊断领域具有广阔的应用前景。同时，唾液中蕴藏着丰富的外泌体，对其进行研究有望为各种疾病发现早期诊断的生物标志物。