[发明专利]甲基化检测方法

摘要

确定给定的单一核苷酸是被甲基化的还是未被甲基化的方法，其特征在于下述步骤：(a)使所述单一核苷酸与一种或多种杂交探针类型接触，每种所述杂交探针类型在其未使用形式包含：(1)连接一个或多个处于基本不可检测状态的第一可检测元件的第一寡核苷酸，并且所述第一寡核苷酸还包含：(i)双链和单链区，和(ii)连接在所述双链区邻近所述单链区的末端的耐受核酸外切降解的区域，和(2)连接一个或多个也处在基本不可检测状态的第二可检测元件的第二单链寡核苷酸，并且改变所述第二单链寡核苷酸为至少部分是所述第一寡核苷酸的单链区的核苷酸序列互补物；(b)对于引起(i)所述单一核苷酸与所述耐受核酸外切降解的区域和所述单链区结合，和(ii)所述第二寡核苷酸与所述单一核苷酸和所述单链核苷酸区结合，以产生基本上双链的使用的探针的相关的探针类型；(c1)将所述使用的探针用甲基化依赖性限制性内切核酸酶在如果所述单一核苷酸被甲基化，则所述使用的探针在邻近耐受核酸外切降解的区域处被切割成两个双链寡核苷酸产物的条件下处理，或者(c2)将所述使用的探针用甲基化敏感性限制性内切核酸酶在如果所述单一核苷酸未被甲基化，则所述使用的探针在邻近耐受核酸外切降解的区域处被切割成两个双链寡核苷酸产物的条件下处理；并且，然后(d1)将步骤(c1)的产物用外切核酸酶或展现出外切核酸酶活性的聚合酶处理，使得如果所述单一核苷酸被甲基化，则仅释放处于可检测状态的第一可检测元件或释放处于可检测状态的第一和第二可检测元件二者，或如果所述单一核苷酸未被甲基化，则仅释放第二可检测元件，或者，(d2)将步骤(c2)的产物用外切核酸酶或展现出外切核酸酶活性的聚合酶处理，使得如果所述单一核苷酸未被甲基化，则仅释放处于可检测状态的第一可检测元件或释放处于可检测状态的第一和第二可检测元件二者，或如果所述单一核苷酸被甲基化，则仅释放第二可检测元件。

主权项

1.一种确定给定的单一核苷酸是被甲基化的还是未被甲基化的方法，所述方法特征在于下述步骤：(a)使处于分离的核苷酸三磷酸酯分子形式的所述单一核苷酸与一种或多种杂交探针类型接触，每种所述杂交探针类型在其未使用形式包含：(1)包括5'突出和连接一个或多个处于基本不可检测状态的第一可检测元件的第一发夹寡核苷酸，并且所述第一寡核苷酸还包含：(i)双链和单链区，和(ii)位于在所述双链区邻近所述单链区的3'末端的耐受核酸外切降解的区域，和(2)连接一个或多个也处在基本不可检测状态的第二可检测元件的第二单链寡核苷酸，并且改变所述第二单链寡核苷酸为至少部分从所述突出的第二核苷酸开始与所述5'突出互补；(b)使所述第二单链寡核苷酸与所述5'突出杂交，和通过使用聚合酶和连接酶使分离的单一核苷酸结合到第一寡核苷酸的3'端和第二寡核苷酸的5'端，以产生基本上双链的使用的探针的相关的探针类型；(c1)将所述使用的探针用甲基化依赖性限制性内切核酸酶在如果所述单一核苷酸被甲基化，则所述使用的探针在邻近耐受核酸外切降解的区域处被切割成两个双链寡核苷酸产物的条件下处理，或者(c2)将所述使用的探针用甲基化敏感性限制性内切核酸酶在如果所述单一核苷酸未被甲基化，则所述使用的探针在邻近耐受核酸外切降解的区域处被切割成两个双链寡核苷酸产物的条件下处理，从而在任一情况下使得所述耐受核酸外切降解的区域保持与包含第二寡核苷酸的切割的使用的探针部分连接；并且，然后(d1)将步骤(c1)的产物用外切核酸酶或聚合酶处理，所述外切核酸酶或聚合酶各自展现出3'-5'双链外切核酸酶活性并且既没有5'-3'也没有单链外切核酸酶活性，使得如果所述单一核苷酸被甲基化，则仅释放处于可检测状态的第一可检测元件或释放处于可检测状态的第一和第二可检测元件二者，或如果所述单一核苷酸未被甲基化，则仅释放第二可检测元件，或者，(d2)将步骤(c2)的产物用外切核酸酶或聚合酶处理，所述外切核酸酶或聚合酶各自展现出3'-5'双链外切核酸酶活性并且既没有5'-3'也没有单链外切核酸酶活性，使得如果所述单一核苷酸未被甲基化，则仅释放处于可检测状态的第一可检测元件或释放处于可检测状态的第一和第二可检测元件二者，或如果所述单一核苷酸被甲基化，则仅释放第二可检测元件。/n