[发明专利]一种基于纳米金生长的生物酶活性检测方法

摘要

本发明涉及一种基于纳米金生长的生物酶活性检测方法。生物酶催化底物水解后所产生的糖类化合物具有还原性，在一定条件下，能与氯金酸反应生成纳米金，使溶液显色，根据溶液吸光度的大小可以推测酶活力的大小。该方法包括以下步骤：第一步，工作曲线的绘制；第二步，酶解反应；第三步，生物酶活性的测定。本发明所述的检测方法准确可靠、实用性强、仪器要求简单，适用于常规条件下的操作，是测定生物酶活力显色法中一种可靠的方法。

主权项

1.一种基于纳米金生长的生物酶活性检测方法，该方法适用于满足下列条件的所有生物酶活性的检测，即生物酶作用底物不与氯金酸反应，酶催化底物生成的产物中含有糖类化合物，且这些糖类化合物在特定条件下能与氯金酸反应生成纳米金。其特征在于：a、工作曲线的绘制：将糖类化合物标准品稀释成一系列的标准液，将一系列的标准液分别与氯金酸反应形成不同浓度的纳米金溶液，通过测定各反应液的吸光度，得到糖类化合物浓度与吸光度关系工作曲线。糖类化合物与氯金酸反应的条件为：反应混合液中含氯金酸1‑2mM，十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)或者十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)3.6‑12mM，以及氢氧化钠3‑5M；反应混合液于70℃反应10‑15min。b、酶解反应：在试管中加入以乙酸‑乙酸钠缓冲溶液配制的底物溶液V1mL，置于水浴中预热5min，加入酶稀释液V2mL得到混合液，将混合液在水浴中反应30min后，取V3μL混合液加入1支新的试管中，然后与氯金酸反应，并使溶液的总体积为V4μL；上述酶解反应做3次平行实验，测定结果取平均值。c、生物酶活性的测定：酶解反应完成后用紫外可见分光光度计测量适宜波长条件下混合溶液的吸光度值，根据溶液吸光度与工作曲线确定酶催化底物水解所产生的还原糖的浓度；定义1g生物酶在适宜条件下，每分钟水解底物溶液释放1μmol还原糖所需的酶量为一个活力单位，以IU表示。根据如下公式计算生物酶的活力：其中，X为生物酶的活力，以IU表示；P为标准曲线上对应的还原糖的浓度，单位为g/L；C为酶液的原始浓度，单位为g/L；t为酶反应时间，单位为min；M为还原糖的摩尔质量；V1、V2、V3、V4如上文b所述；106为转化因子；Df为酶液稀释倍数。