[发明专利]一种基于纳米金生长的生物酶活性检测方法

说明书

本发明涉及一种基于纳米金生长的生物酶活性检测方法。生物酶催化底物水解后所产生的糖类化合物具有还原性，在一定条件下，能与氯金酸反应生成纳米金，使溶液显色，根据溶液吸光度的大小可以推测酶活力的大小。该方法包括以下步骤：第一步，工作曲线的绘制；第二步，酶解反应；第三步，生物酶活性的测定。本发明所述的检测方法准确可靠、实用性强、仪器要求简单，适用于常规条件下的操作，是测定生物酶活力显色法中一种可靠的方法。

技术领域

本发明涉及纳米科技领域和酶活性检测方法领域，尤其涉及纳米材料在生物酶活性检测中的应用。

背景技术

酶制剂生产、应用和研究等各个环节都离不开酶活性的测定，如在发酵过程中通过测定酶的活性以达到最大产酶量；在提炼过程中通过测定酶活性掌握酶的去向，以达到最好的收率；在酶的应用过程中通过测定酶活性，以掌握好用酶量。因此，在酶制剂的生产、应用和研究过程中准确测定酶活性都是十分重要的，开发简便、精确、快速的酶活性测定研究方法具有重要的意义。

目前，分光光度法是检测生物酶活性最普遍的方法，一般选用3，5-二硝基水杨酸(DNS)作为显色剂。此方法的原理是：生物酶将底物降解为还原糖，还原糖在沸水浴条件下与DNS试剂发生显色反应，反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，还原糖的生成量又与反应液中生物酶的活力成正比，通过分光光度计测定反应液的吸光度，从而计算出反应液中生物酶的活力。虽然此法具有很好的操作性，但仍存在不足之处，例如显色剂DNS溶液配制繁琐且等待时间长，需具备一定技术水平的专业人员配制，若试剂配制不成功，直接影响实验结果。因此，寻找合适的试剂代替DNS显色剂，建立一种新的分光光度法来检测生物酶的活性仍然是需要解决的问题。

纳米材料是近年来的研究热点之一，以其独特的性能被广泛应用于物理、化学、电子、材料等各个领域。其中，由于纳米金具有优异的光学性能，在生化分析领域得到广泛应用。研究表明，在一定条件下，一些具有还原性的待测物能与氯金酸反应生成纳米金，使溶液由无色或淡黄色转变为酒红色或紫色，且纳米金溶液的吸光度与待测物的浓度存在定量关系。采用这种方法实现了神经递质、过氧化氢、抗氧化剂、β-兴奋剂以及四环素类抗生素等多种物质的检测。本发明在上述工作的启发下，提出利用纳米金生长的反应检测生物酶的活性。其原理是：生物酶将底物降解为还原糖，还原糖在一定反应条件下与氯金酸反应生成纳米金，在紫外-可见光谱中，纳米金溶液的吸光度与酶解产生的还原糖量成正比，还原糖的量又与反应液中生物酶的活力成正比，从而计算出反应液中生物酶的活力。本发明所建立的检测方法，可以作为现有生物酶活性检测方法的补充，丰富了酶活性的检测方法，为酶的活性检测提供更多的选择。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于纳米金生长的生物酶活性检测方法。

本发明的目的通过如下技术措施来实现：

a、工作曲线的绘制：将糖类化合物标准品稀释成一系列的标准液，将一系列的标准液分别与氯金酸反应形成不同浓度的纳米金溶液，通过测定各反应液的吸光度，得到糖类化合物浓度与吸光度关系工作曲线。

b、酶解反应：在试管中加入以乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制的底物溶液V₁mL，置于水浴中预热5min，加入酶稀释液V2mL得到混合液，将混合液在水浴中反应30min后，取V₃μL混合液加入1支新的试管中，然后与氯金酸反应，并使溶液的总体积为V₄μL；上述酶解反应做3次平行实验，测定结果取平均值。

c、生物酶活性的测定：酶解反应完成后用紫外可见分光光度计测量适宜波长条件下混合溶液的吸光度值，根据溶液吸光度与工作曲线确定酶催化底物水解所产生的还原糖的浓度；定义1g固体酶粉(或者1mL液体酶)在适宜条件下，每分钟水解底物溶液释放1μmol还原糖所需的酶量为一个活力单位(IU)，根据如下公式计算生物酶的活力：