[发明专利]一种快速鉴别N1、N2亚型流感病毒的方法

摘要

本发明公开了一种快速测定N1、N2亚流感病毒的方法，本发明采用一步法荧光定量RT‑PCR检测方法，将Buffer、dNTP、Enhance solution预混成2X one‑step buffer，将多种酶配比进行混合，使本发明的操作的反应液配制更为简单方便，缩短操作时间，同时避免了操作污染，本发明操作简便、敏感性好、方便快捷，适合开发检测用的N1和N2鉴别检测荧光定量RT‑PCR试剂盒，用于N1和N2亚型的临床鉴别诊断和流行病学调查，对我国流感的防控具有重要意义。

主权项

1.一种快速鉴别检测禽类动物N1、N2亚型流感病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：取以下浓度及体积的反应试剂放入反应管中混匀：2X one‑step RT‑PCRBuffer                                  12.5μL；三种混合酶RNase inhibitor                                           5UM‑MLV                                                     40UTaq HS                                                    3U；N1‑fwd             20μM                                   0.5μL；N1‑rev             20μM                                   0.5μL；N2‑fwd             20μM                                   0.5μL；N2‑rev             20μM                                   0.5μL；N1 probe           10μM                                   0.5μL；N2 probe           10μM                                   0.5μL；N1 RNA模板                                                10ng‑1μg；N2 RNA模板                                                10ng‑1μg；RNase‑free ddH2O                                          补至25μL；启动荧光PCR仪器，将反应管放入PCR仪器中；RT‑PCR反应条件：第一步20min 42℃，第二步94℃ 1min，第三步95℃ 15s，60℃ 30s，进行45个循环，4℃ 保存；60℃采集荧光，检测扩增曲线；所述N1‑fwd的碱基序列如SEQ IN NO:1所示；所述N1‑rev的碱基序列如SEQ IN NO:2所示；所述N2‑fwd的碱基序列如SEQ IN NO:3所示；所述N2‑rev的碱基序列如SEQ IN NO:4所示；所述N1 probe的碱基序列如SEQ IN NO:5所示；所述N2 probe的碱基序列如SEQ IN NO:6所示；所述N1 probe5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的淬灭基团为BQ1；N2 probe5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的淬灭基团为BQ2；N1 RNA模板或N2 RNA模板的制备方法如下：取含N1或N2亚型的病毒，按照Trizol试剂说明提取病毒RNA，取1.5mL的无RNA酶的EP管中加入200μL尿囊液和1mL的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体；加入0.2mL的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2‑3min，然后离心12,000×g，15min，4°C；离心后管内分成三层，下面的红色为酚‑氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相；RNA沉淀 小心将上层水相转移到另一无RNA酶的EP管中，加入等量体积的预冷异丙醇，室温静置10min，离心12,000×g，15min，4°C;离心后可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀；RNA洗涤 去上清，向沉淀中加入1mL75%预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，轻轻混匀，离心12,000×g，5min，4°C；RNA溶解 去上清，超净台内风干RNA沉淀，加入20μLDEPC水充分溶解RNA。