[发明专利]一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法

摘要

本发明公开了一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法，该鉴定方法步骤如下：1）获取带毒灰飞虱和鉴定标尺；2）带毒灰飞虱定量传毒胚芽鞘；3）荧光定量PCR获得每个品种周期时间点的RQ值；4）绘制RBSDV增殖指数趋势线并进行抗性评价。本发明能够在水稻萌芽期在分子水平上准确地鉴定水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级，鉴定周期短且准确度高，具有较大的育种应用价值。

主权项

1.一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法包括以下步骤：1）获取带毒灰飞虱和鉴定标尺：大田采集灰飞虱高龄若虫并纯化筛选，传代保存，鉴定前采用RBSDV毒源饲毒1.5‑2.5龄期灰飞虱若虫，获得带毒灰飞虱；根据人工接毒鉴定中不同水稻品种对水稻黑条矮缩病抗性表现设置高抗、中抗、感病三个鉴定标尺，选择三个相应水稻品种做为鉴定标尺；2）带毒灰飞虱定量传毒胚芽鞘：每个品种取15‑20粒种子，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25℃条件下适宜浓度的IAA溶液中低氧浸种培养3天，诱导出胚芽鞘；将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管中，每个试管一个种子，定量接种带毒灰飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒24h；传毒后胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25℃条件下浸润了适宜浓度的ABA溶液的吸水棉上暗培养；3）荧光定量PCR获得每个品种周期时间点的相对表达量，即RQ值：按照周期时间点取材上一步骤的胚芽鞘的特定部位，取材2‑3重复，提取并纯化病毒RNA，荧光定量PCR扩增RBSDV病毒S9片段，.扩增完毕，进入结果分析界面，以OsUBQ5为内参，与对照组相比，获得每个品种每个取样时间点重复的RBSDV病毒S9与内参基因的RQ值；4）绘制RBSDV增殖指数趋势线并进行抗性评价：用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲毒后每个取样时间点的RQ值均值，然后以RQ值均值为纵坐标，周期取样时间点为横坐标，对数据进行统计分析，获得RBSDV增殖指数趋势线y=Aekx，然后根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级；所述步骤1）中的带毒灰飞虱的获取步骤为：1.1）RBSDV毒源获取：从水稻黑条矮缩病重病区田间采集表现为水稻黑条矮缩病症状的分蘖盛期水稻病株，‑70℃保存；1.2）传毒介体继代繁殖：大田采集并纯化灰飞虱高龄若虫，用水稻幼苗饲养并传代；1.3）介体饲毒：饲毒时从‑70℃冰箱中取出水稻黑条矮缩病病株，常温放置3‑5h使病株自然展开，然后用吸水棉布包裹病株根部后用塑料袋紧密包扎，确保水不会流出，然后将其移入保鲜盒内，将室内人工饲养的1.5‑2.5龄期灰飞虱若虫转入保鲜盒内的RBSDV毒源水稻上，25℃饲毒48h后移除毒源，将灰飞虱转移到幼嫩水稻秧苗上饲养度过循回期即为带毒灰飞虱；所述步骤1）中的高抗鉴定标尺为室内接毒鉴定中抗病表现在当地水稻品种资源中排名为9%‑11%；中抗鉴定标尺排名为23%‑27%；感病鉴定标尺排名为47%‑53%；所述步骤2）中的适宜浓度的IAA溶液浓度为1.5‑2.5μmol/L；所述的低氧浸种方法为种子置于液面下5‑10cm处培养；所述的适宜浓度的ABA溶液浓度为40‑60μmol/L；所述步骤2）中的定量接种带毒灰飞虱为5‑8虫/个胚芽鞘的比例；所述步骤3）和步骤4）中的周期取样时间点为RBSDV传毒后4‑10天内每隔1.5‑2.0天均匀分布的3‑4个时间点；所述步骤3）中的胚芽鞘的特定部位为胚芽鞘长度的正中间部位；所述步骤3）中的RNA提取方法为：取适量叶片加液氮于研钵中迅速磨碎，按比例加入TRI‑Reagent到1.5ml离心管中，样品体积不应超过TRI‑Reagent体积10%，4℃12000×g低温离心1.5min，然后小心转移上清到新的离心管中；所述的RNA纯化方法为：a）直接添加一体积95%‑100%酒精到已经溶解于TRI‑Reagent的上清液中，漩涡混匀；b）转移到吸附柱中过滤，吸附柱置于收集管中，然后12000×g离心1min，之后把吸附柱转移到新的收集管中；c）加400μl RNA Wash Buffer到离心柱中，12000×g离心1min；d）将80μl配好的DNAase I cocktail buffer直接加到离心柱中，25‑37℃水浴加热离心柱15min，12000×g离心30s；e）添加400μl RNA Prewash到吸附柱中，12000×g离心1min，收集过滤的液体，重复此步骤；f）添加700μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，12000×g离心1min，然后从收集管中小心转移吸附柱到一个新的RNase‑free 1.5ml离心管中；g）至少添加25μl DNase/RNase‑Free Water 到离心管基质中，最大速度离心1min，被洗脱的RNA可以直接利用或保存于‑70℃超低温冰箱中；所述步骤3）中的荧光定量PCR所采用的引物为RBSDV病毒S9片段引物：RBSDV‑F：5’‑GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT‑3’和RBSDV‑R：5’‑ GGATTACAACAHACACAMCGAAA‑3’；荧光定量反应体系：每20μL中含10μL的2×qPCR master mix、1.0μL的cDNA模板、8.2μL的ddH2O以及0.8μL的10µM引物RBSDV‑R和RP；实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共进行40次循环，95℃变性15s，60℃退火1min，95℃变性15s；所述步骤4）中的根据RBSDV增殖指数趋势线公式评价待测水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级的划分方法为：4.1）待测品种抗性水平划分：根据每个品种RBSDV增殖指数趋势线公式y=Aekx评价待测水稻品种的抗性水平，即公式中k值大的品种比k值小的品种对RBSDV抗性低；4.2）待测品种抗性等级划分：根据待测品种和鉴定标尺k值大小来评价待测品种的抗性等级，即待测品种k值小于等于高抗标尺为高抗品种；待测品种k值大于高抗标尺且小于等于中抗标尺的为中抗品种；待测品种k值大于中抗标尺且小于等于感病标尺为感病品种；待测品种k值大于感病标尺为超感品种；所述步骤1.3）中的灰飞虱饲毒后的循回期为22‑28天。