[发明专利]一株产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌及其在1,3-丙二醇生产中的应用

摘要

本发明公开了一株产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌及其在1,3-丙二醇生产中的应用。本发明利用同源重组、基因缺失失活的方法使产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌野生型菌株中乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因沉默，从而得到产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌。用本发明的工程菌进行1,3-丙二醇的发酵生产，副产物乳酸和乙醇产量大幅度降低，目标产物1,3-丙二醇的终浓度、生产强度和转化率都得到明显提升。另外，由于副产物产量的大幅降低，也可以简化后提取的工艺。本发明可提高微生物发酵法生产1,3-丙二醇的生产效率，降低生产成本，具有重要的应用价值。

主权项

一株产乳酸和乙醇途径缺失的工程菌的构建方法，将克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因敲除后获得的工程菌，其特征在于，将SEQ ID NO.1的克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶基因和SEQ ID NO.2的乙醇脱氢酶基因敲除，具体敲除方法如下：(1)PCR扩增克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶基因在基因组中上游和下游的部分同源序列，将其与自杀载体相连，然后再导入杂交供体菌中；(2)将步骤(1)获得的携带有乳酸脱氢酶基因上游和下游部分同源序列的自杀载体的供体菌与克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组使乳酸脱氢酶基因缺失失活，经筛选后获得乳酸脱氢酶基因被敲除的克雷伯氏菌。(3)PCR扩增克雷伯氏菌的乙醇脱氢酶基因在基因组中上游和下游的部分同源序列，将其与自杀载体相连，然后再导入杂交供体菌中；(4)将步骤(3)获得的携带有乙醇脱氢酶基因上游和下游部分同源序列的自杀载体的供体菌与步骤(2)获得的乳酸脱氢酶基因被敲除的克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组使乙醇脱氢酶基因缺失失活，经筛选后获得乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因都被敲除的克雷伯氏菌。