[发明专利]生物膜蛋白质的提取方法和电泳样品的制备方法

摘要

本发明提供了一种生物膜蛋白质的提取方法和电泳样品的制备方法，提取方法包括以下步骤对生物膜样品进行预处理以得到沉淀物；将该沉淀物与裂解液和苯甲基磺酰氟溶液混合，在冰浴条件下超声裂解，得到样品裂解液；震荡并离心样品裂解液，取上清液并采用TCA‑丙酮沉淀法对其进行处理，得到蛋白质样品；制备方法包括以下步骤使用溶解液溶解蛋白质样品，依次进行超声、涡旋振荡和离心，取上清液得到电泳样品；本发明的方法采用了含有多种去垢剂的裂解液并结合冰浴超声对微生物细胞进行破壁，同时采用TCA‑丙酮沉淀法提纯蛋白质，不仅能有效地提取生物膜样品中的全蛋白，还能降低腐殖质对蛋白质的掩蔽作用，使电泳的分析结果清晰。

主权项

一种生物膜蛋白质的提取方法，其特征在于：由如下步骤组成：(1).对生物膜样品进行预处理，得到沉淀物；(2).将步骤(1)所得沉淀物与裂解液和苯甲基磺酰氟溶液混合，在冰浴条件下超声裂解，得到样品裂解液；(3).将步骤(2)所得样品裂解液震荡并离心，取上清液，采用TCA‑丙酮沉淀法对所述上清液进行处理，得到蛋白质样品；步骤(1)中的生物膜样品的提取方法为：从蚯蚓生物滤池的滤床内取出带有生物膜的陶粒，用蒸馏水将其上附着的生物膜冲下后，用1mm孔径的筛子筛分以去除杂质颗粒，收集筛下物，以8000rpm的速度于4℃下离心5min以收集生物膜，并将其作为生物膜样品；步骤(1)中的预处理包括如下步骤：a.采用浓度为9±1mg/mL的氯化钠溶液洗涤所述生物膜样品，以8000±1000rpm的转速于4±1℃下离心5±1min，收集沉淀；b.采用磷酸缓冲盐溶液洗涤步骤a所得沉淀，涡旋振荡后以8000±1000rpm的转速于4±1℃下离心5±1min，得到所述沉淀物；在步骤(2)中，所述裂解液的成分为：50mmol/L pH＝7.4的Tris、150mmol/L的NaCl、1±0.5wt％的Triton X‑100、1±0.5wt％的脱氧胆酸钠和0.1±0.05wt％的SDS，其余成分为去离子水；在步骤(2)中，所述苯甲基磺酰氟溶液的浓度为100±10mmol/L；在步骤(2)中，超声的强度为250‑300W，超声的时间为20±10个周期，每个周期内连续超声20秒并且停止超声10秒；在步骤(3)中，所述TCA‑丙酮沉淀法包括如下步骤：a.将所述上清液与三氯乙酸以(9±3)︰(1±1)的体积比混合，于4±1℃下静置，然后离心，得到初级沉淀物；b.将步骤a所得初级沉淀物用三倍于所述初级沉淀物体积的预冷后的丙酮洗涤，于4±1℃下静置并离心，得到次级沉淀物；c.重复步骤b两至三次，最后一次得到的沉淀物不完全吹干，得到蛋白质样品。