[发明专利]生物膜蛋白质的提取方法和电泳样品的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物处理技术领域，涉及一种生物膜蛋白质的提取方法和电泳样品的制备方法。

背景技术

许多研究证明，通过传统的分离培养方法鉴定的微生物只占天然环境微生物总数的1％。近年来，新兴的宏蛋白质组学是一种运用蛋白质组技术对特定微生物群落所产生的全部蛋白质进行大规模研究与分析的新技术，也是一种探索微生物群落结构的新策略。通过宏蛋白质组研究能够把微生物群落组成与其生态功能联系起来，从而更好地了解系统中的功能微生物。

随着对微生物和环境微生物的宏基因的测序研究的不断深入和发展，对基因表达蛋白质的研究更加重要。尽管宏基因组学研究能够提供很多有价值的数据，其弊端也显现出来：，比如，由于重复基因的出现和基因表达的时空性等原因，造成了微生物的基因表达不能通过宏基因组的研究来解释。此外，微生物对物质的转化主要是通过其分泌的酶来实现的。众所周知，大多数酶的化学本质是蛋白质，因此，在基因组、转录组、蛋白质组、代谢组这4个研究层次中，蛋白质组学是最直接的对特定环境和特定时刻生物功能本质的研究，这种研究具有较大的生物学意义。尽管现在只开展了少数的宏蛋白质组学研究，但是其在环境微生物研究中的巨大作用已经显现出来。

Wilmes.P.等人在生物强化除磷系统中鉴定出了702个与A.phosphatis有关的蛋白点，并指出在好氧和厌氧环境下，仅有3％的蛋白表达产生显著差别。Lv.F.等人研究纤维素的厌氧消化处理时发现微生物能够对纤维素进行剧烈水解作用，并且检测到了分子生物技术未能检出的具有纤维素分解功能的微生物。Kan等人对Chesapeake海湾海水微生物群落进行研究通过2D电泳发现该海湾不同水域蛋白质组存在较大差异，通过对有表达差异的7种蛋白质谱分析，鉴定出4种新的蛋白质。因此，微生物的蛋白表达是随着时间和空间的变化而变化的动态信息，能够更加直接具体地给出关于微生物活性方面的信息，因而宏蛋白质组学在微生物群落功能分析、代谢与环境相互作用过程中具有更大的潜力。

进行宏蛋白质组学分析的关键步骤是实现对样品中蛋白质的有效提取。Taylor等模拟天然环境，对培养的微生物样品进行了两种提取方法的比较。结果显示直接提取法的蛋白质SDS-PAGE图像模糊不可辨，而且蛋白质回收率很低；DGC-EXT提取法的SDS-PAGE图像有6～10条带，说明先收集细胞再提取蛋白法(DGCEXT提取法)优于直接提取法。Wilmes.P.等对活性污泥的蛋白质提取进行了不同细胞破碎法、不同洗涤及裂解缓冲液、不同蛋白沉淀及溶解方法对蛋白提取效果的影响的研究，最终确定了一种适合活性污泥的总蛋白提取方法。Kuhn.R.等人采用了酚提法来提取MBR反应器中活性污泥的蛋白质。苯酚对其中的腐殖质有一定的萃取作用，并对粗提液进行了多次醋酸铵沉淀最终获得了可用于2D电泳分析的蛋白质溶液。由于环境样品的复杂性，目前仍然没有通用的适用于提纯各种环境下微生物总蛋白的方法，尤其是从生物膜或活性污泥等环境中提取蛋白还是有很多的困难。

对污水污泥处理中微生物的宏蛋白质组学主要集中于活性污泥。然而，在自然环境下，与活性污泥系统相比，生物膜也是个复杂的生态系统，诸多因素共同影响着污染物的迁移、转化以及微生物的群落结构，目前，对于生物膜系统的研究大都是在实验室可控条件下开展的，需要预先培养或者富集特定微生物。另外，生物膜是复杂的微生物聚集体，食物链长，腐殖化程度明显，生物膜中各种微生物以附着形式生长，在滤料表面繁殖形成致密的生物膜，其结构与微生物种类往往比活性污泥菌胶团更加复杂和多样。而且在生物膜老化的过程中产生的腐殖质会与微生物释放和分泌的蛋白质结合，难以分离导致样品提纯难度大，是这一研究中存在的最大困难。加上蛋白质技术又没有类似于PCR的扩增手段等，对于蛋白质含量低的样品分析更加困难。现有的各种蛋白质提取方法运用于生物膜效果都不尽人意，目前还没有一种提取生物膜总蛋白质的通用有效的方法，这也是导致宏蛋白质组学在环境研究方面的迟滞最重要原因。

目前被宏蛋白质组研究者广泛使用的由Wilmes.P.建立的方法，发明人重复该方法提取生物膜的蛋白质，没有获得理想的效果，表明该方法缺乏较好的通用性。因此提出了新的高效、通用的蛋白质提取方法对宏蛋白质组学研究与应用至关重要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种生物膜蛋白质的提取方法，该种方法能够对来自于生物膜的蛋白质进行有效提取，其无需对特定的微生物进行预先培养或者富集，同时也能够降低腐殖质对蛋白质的掩蔽作用，使蛋白质能够很好地与腐殖质相脱离。