[发明专利]一种魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法

摘要

本发明公开了一种魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法，包括采集并处理供试样品、准备培养基微生物分离计数、优势菌株鉴定、土壤pH及养分测定、数据处理；本发明的魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法，对魔芋软腐病发生的土壤微生物群落结构改变研究，开辟了有关魔芋软腐病发生的微生态机制研究的先河，具有重大意义。通过本发明的魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法的研究，发现在魔芋软腐病株根域，有9种优势微生物大量存在：3种优势细菌为变形假单胞菌、绿针假单胞菌致金色亚种及寡养食单胞菌；4种优势真菌为腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、变灰青霉及青霉；2种优势放线菌为疮疥链霉菌、淀粉酶产色链霉菌。

主权项

一种魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法，其特征在于：具体包括以下步骤：(1)采集并处理供试样品：在连作第4年的魔芋种植基地，采集农田中与玉米间作的健康及典型软腐症状的魔芋全植株及其根外土壤、根区土壤、根表土壤及根系，样品采集及处理参照现有方法进行；(2)准备培养基：牛肉膏蛋白胨、马铃薯蔗糖及高氏1号培养基；(3)微生物分离计数：稀释平板涂抹法分离计数微生物数量。细菌、真菌及放线菌分别采用牛肉膏蛋白胨、马铃薯蔗糖及高氏1号琼脂培养基，均设3个稀释度，每个稀释度重复3皿，28℃倒置培养，细菌2d，真菌3d，放线菌8d后计数，同时挑取优势菌纯化后于斜面培养基保藏；芽孢细菌与荧光细菌数量：将细菌培养基上菌落呈蜡样光泽、皱褶，具有典型芽孢杆菌特征的细菌菌落计数为芽孢菌；将细菌培养基上所有呈现荧光的菌落均计数为荧光细菌；链霉菌属：将高氏1号培养基上具有典型链霉菌属菌落形态特征的放线菌计数为链霉菌；(4)优势菌株鉴定：采用酶解法分别提取细菌、放线菌总DNA，均采用细菌通用引物PA、PB进行16SrRNA基因扩增；采用CTAB法提取真菌总DNA，rDNA‑ITS扩增引物为真菌通用引物；将扩增产物进行测序，采用BLAST方法和CLUSTALX2.0软件将获得的序列与NCBI中高相似度序列进行同源性比对，Mega5.0软件中Neighbor‑Joining法构建系统进化树；(5)土壤pH及养分测定：使用DELTA 320pH计测定土壤pH；重铬酸钾氧化‑外加热法测定有机质含量；NH4‑N含量采用2mol·L‑1KCl浸提，流动分析仪测定；速效P含量采用0.5mol·L‑1NaHCO3浸提，钼锑抗比色法测定；速效K含量采用1mol·L‑1NH40Ac浸提，火焰光度法测定。(6)数据处理：采用SPSS17.0软件进行数据分析，Duncan法进行差异显著性检验，病株以D表示，各项指标较健株的增率用ΔH％表示，健株以H表示，按公式一计算。供试样品中某种优势细菌数量占该样品中细菌总数的比例用P％表示，按公式二计算；某种优势真菌及放线菌所占比例计算与细菌相同；公式一：ΔH%=D-HH×100;]]>公式二：