[发明专利]一种魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法，属于菌落研究分析领域。

背景技术

软腐病是造成魔芋减产、品质下降最严重的细菌性种传和土传病害。引起魔芋软腐病流行的原因复杂，其中土壤微生物区系异常是主要原因之一。董坤等分析了土壤微生物数量与魔芋软腐病的相关性，发现土壤中细菌、镰刀菌及卵菌数量与软腐病发病率呈正相关，放线菌数量与软腐病发病率呈负相关。但不清楚除软腐病菌外哪些微生物影响了魔芋根系病害发生，尚无魔芋软腐病发病植株根域土壤微生物群落结构研究报道。本文拟通过对魔芋软腐病株与健株根域土壤微生物区系及土壤养分的系统比较研究，探索魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构特征，进而揭示魔芋软腐病发生的微生态机制，以期为利用微生态调控技术防治魔芋软腐病提供科学依据。

已有研究表明，放射型根瘤菌能抑制植物病原细菌青枯雷尔氏菌、植物病原真菌西瓜果斑病菌和棉花黄萎病大丽轮枝菌，也能促进甜瓜幼苗生长。苏云金芽孢杆菌是目前世界上应用范围最广、效果最好的绿色环保型微生物杀虫剂，其胞内毒蛋白对一代二化螟等多种害虫有杀灭作用。该菌数量多，可能通过减少魔芋根区、根表土壤害虫数量及害虫对魔芋根系的侵害减轻了病原微生物的侵染，降低了软腐病的发病率。烟曲霉对烟草青枯病原细菌茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)有稳定的拮抗作用，其次生代谢产物也具有抗菌和抗肿瘤活性。纤维素链霉菌对番茄叶霉病有防治作用[34]。在魔芋健株根区、根表土壤或根系中，以上4种优势菌大量存在可能与魔芋健康生长密切相关，为魔芋健康生长时特有的土壤微生物群落结构。

多年来，对魔芋软腐病的研究及防治重点一直集中在软腐病原细菌，对其余有害微生物重视不够。魔芋软腐病流行原因复杂，其中，连作导致田间有害微生物积累、土壤微生物种群结构失衡是引起魔芋软腐病发生的一个重要原因。近年来，国内外学者在苹果、马铃薯及黄瓜等作物土传病害发生与根际土壤微生物区系变化方面取得了重要的研究成果，但引起魔芋软腐病发生的土壤微生物群落结构改变研究很少，有关魔芋软腐病发生的微生态机制未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法，对魔芋软腐病发生的土壤微生物群落结构改变研究，开辟了有关魔芋软腐病发生的微生态机制研究的先河，具有重大意义。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法，其创新点在于：具体包括以下步骤：

(1)采集并处理供试样品：在连作第4年的魔芋种植基地，采集农田中与玉米间作的健康及典型软腐症状的魔芋全植株及其根外土壤、根区土壤、根表土壤及根系，样品采集及处理参照现有方法进行；

(2)准备培养基：牛肉膏蛋白胨、马铃薯蔗糖及高氏1号培养基；

(3)微生物分离计数：稀释平板涂抹法分离计数微生物数量。细菌、真菌及放线菌分别采用牛肉膏蛋白胨、马铃薯蔗糖及高氏1号琼脂培养基，均设3个稀释度，每个稀释度重复3皿，28℃倒置培养，细菌2d，真菌3d，放线菌8d后计数，同时挑取优势菌纯化后于斜面培养基保藏；

芽孢细菌与荧光细菌数量：将细菌培养基上菌落呈蜡样光泽、皱褶，具有典型芽孢杆菌特征的细菌菌落计数为芽孢菌；将细菌培养基上所有呈现荧光的菌落均计数为荧光细菌；

链霉菌属：将高氏1号培养基上具有典型链霉菌属菌落形态特征的放线菌计数为链霉菌；

(4)优势菌株鉴定：采用酶解法分别提取细菌、放线菌总DNA，均采用细菌通用引物PA、PB进行16SrRNA基因扩增；

采用CTAB法提取真菌总DNA，rDNA-ITS扩增引物为真菌通用引物；将扩增产物进行测序，采用BLAST方法和CLUSTALX2.0软件将获得的序列与NCBI中高相似度序列进行同源性比对，Mega5.0软件中Neighbor-Joining法构建系统进化树；

(5)土壤pH及养分测定：使用DELTA 320pH计测定土壤pH；重铬酸钾氧化-外加热法测定有机质含量；NH4-N含量采用2mol·L^-1KCl浸提，流动分析仪测定；速效P含量采用0.5mol·L^-1NaHCO₃浸提，钼锑抗比色法测定；速效K含量采用1mol·L^-1NH40Ac浸提，火焰光度法测定。