[发明专利]一种螺旋藻抗肿瘤多肽的三酶解制备方法

摘要

本发明提供一种螺旋藻抗肿瘤多肽的三酶解制备方法。该方法为：取螺旋藻粉，用超纯水配制成浓度为5%的溶液，反复冻融后，冰浴中均质、超声，离心取上清液，冷冻干燥备用；将其配置成的蛋白液，加入胃蛋白酶进行酶解，控制pH值，加入胰蛋白酶进行酶解，加入胰凝乳蛋白酶进行酶解，控制pH值，灭酶，冷却，离心，取上清液；依次用截留分子量分别为10 KD、5 KD以及3 KD的超滤膜过滤，获得三种螺旋藻蛋白酶解液；将0‑3K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G‑15柱层析，水洗脱，收集得到4个多肽组分，即螺旋藻抗肿瘤多肽。本发明得到的螺旋藻多肽和单肽组分，为抗肿瘤药物和保健食品的开发利用奠定了理论基础。

主权项

1.一种螺旋藻抗肿瘤多肽的三酶解制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）取10~50 g螺旋藻粉，用超纯水配制成浓度为5% (w/v)的溶液，反复冻融2‑5次，冰浴中均质、超声，离心取上清液，冷冻干燥备用；（2）取步骤（1）得到的螺旋藻蛋白配置成1%~5%的蛋白液，加入胃蛋白酶在控制条件下进行酶解，酶解过程中使用0.05～0.2 mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间，酶解完后再调节酶解条件，加入胰蛋白酶在控制条件下进行酶解，酶解体系的pH值控制方法同上，之后加入胰凝乳蛋白酶在控制条件下进行酶解，酶解体系的pH值控制方法同上，酶解完毕后灭酶，冷却至室温，将酶解液离心，取上清液；所述胃蛋白酶、胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶三酶解的水解条件是：加入胃蛋白酶，酶解温度37℃，pH=1~2，酶解时间1~3 h，酶与底物浓度比为4~6%（w/w），加入胰蛋白酶，酶解温度37℃，pH=7~9，酶解时间2~4h，酶与底物浓度比为3~5%（w/w），加入胰凝乳蛋白酶，酶解温度37℃，pH=7~9，酶解时间2~4h，酶与底物浓度比为4~6%（w/w）；（3）取步骤（2）得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10 KD、5 KD以及3 KD的超滤膜过滤，从而获得分子量大小范围为0‑3 KD、3‑5 KD，5‑10KD和大于10 KD的螺旋藻蛋白酶解液；所述的超滤在CO2压力为0.1～0.25 MPa的室温下用超滤杯结合10K，5K和3K的超滤膜超滤；（4）取步骤（3）得到的0‑3K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G‑15柱层析，水洗脱，收集得到4个多肽组分，按照出峰的时间顺序，收集得到4个多肽组分，分别命名为Tr1、Tr2、Tr3和Tr4，即螺旋藻抗肿瘤多肽；所述螺旋藻抗肿瘤多肽组份通过 MALDI‑TOF‑TOF质谱分析鉴定得到，Tr1多肽中的其中一条肽分子量为935.567，其中C→N序列为RPARSLVH ；所述的葡聚糖凝胶Sephadex G‑15分离纯化，具体条件为：柱体积为150~200 mL，上样量为1~4 mL，上样浓度为50~150 mg/mL，流动相为水，流速为0.35 mL/min，每8 min收集一管，总共收集160管，检测波长为280 nm。