[发明专利]大菱鲆S11单核苷酸多态性标记的检测方法

摘要

一种大菱鲆S11单核苷酸多态性标记的检测方法，属于分子遗传标记研究技术，首先提取大菱鲆基因组DNA并稀释备用；再根据高通量转录组测序获得SNP位点，采用人工筛查的方法筛选出候选SNP位点的序列，利用小片段法在其两端设计特异引物，长度在20bp左右，目的片段在40-80bp；同时设计高低温内标；然后进行PCR反应，变性时添加高低温内标；将产物置于LightScanner上检测熔解曲线并分析，获得大菱鲆的遗传多态性图谱。本发明适用于大菱鲆群体遗传标记、系谱认证、遗传连锁图谱构建等检测技术；可快捷的获得大菱鲆的S11SNP标记的遗传变异图谱，方便、快捷、准确，可直观地检测出大菱鲆每个个体的基因型。

主权项

一种大菱鲆S11单核苷酸多态性标记的检测方法，包括：1)、基因组DNA提取；2)、候选SNP筛选；3)、小片段引物设计；4)、PCR扩增；5)、数据采集和6)、基因分型；其特征在于所述的候选SNP筛选，通过高通量转录组测序获得SNP位点，采用人工筛查：①只在含有不少于20个reads的contig中寻找SNP；②从突变频率大于20％的SNP位点中挑选，但当reads数大于500时，选择突变频率大于10％的SNP位点；筛查出候选S11SNP位点，其位点所在的conting为comp32333_c1_seq1，部分基因序列为：AAAAGTTGTTTTAATACTGATACAAGGAGGACAGAAGAGTCACAACACAACCATGTGTTCTCCTGAGACCAATGGTTACGAATAGACGAGGCCCCATTCAGTGGTTTCAGGCACTGACAAAAAGAATGAAAAAAGAAAACAGAAGCTCAGAAACCATACTCCTCCGTTAGGTCGGAAAAGGTAAA GTCATAGTCATCAACGTCGTCATCGTCATCACCACTGAGAAGGGTCATGGCTATGAAAAAATTAAGTAGATCTAAGCCATCGTAGTCGTCTTCATCTTCTGTAGGATATGTAAATGATCTGCGACGTGTAGATTTATCATGTCGATAAAGGCACTCCGTTTTGAAGGGGCAGCAT，其中加粗、加下划线的碱基即为S11SNP位点；所述的小片段引物设计：利用软件primer5.0进行引物设计，小片段法引物设计要求：①引物长度20bp左右；②目的片段控制在40bp‑80bp；③引物内部不能包含SNP位点；④GC含量40％‑60％，Tm值在40℃‑60℃，两条引物之间Tm值相差不超过2℃；⑤引物3’末端不能够有连续超过4个碱基的错配或者自身配对；⑥目的产物只含有一个待测SNP位点，通过软件Oligo7.0检查引物质量，不能有严重错配、引物二聚体和发夹结构等；高低温内标为两段长度50bp的DNA片段，提供独立于PCR产物的大约68℃和88℃的熔解曲线，有效的去除混杂变量，减少Tm值对反应体积的依赖，增加基因分型的敏感性，内标序列分别为F：5‑GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG‑3，R：5′‑CTGAGCGTCACGCAGTGCCGCAGCTGGCTACCGCTAGGCCGACTGACCGC‑3′；和F：5′‑ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT‑3′R：5′‑AAAATGAAATTATTAATGCCAACTACTTAGATAACTATAGAAATCACGAT‑3′。