[发明专利]大菱鲆S11单核苷酸多态性标记的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传标记研究技术，具体涉及一种检测大菱鲆S11单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism，SNP)的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)分子标记是基因组中最丰富的突变类型，因它数量多，覆盖密度大，位点丰富，几乎分布于整个基因组，具有片段短易于扩增、遗传稳定性强等特点；易于高通量、自动化分析，易于遗传机制的研究等优势，所以它是遗传育种研究中的热门领域。

本发明做出之前，SNP位点信息的获得主要是通过基因组测序，伴随序列拼接比对而产生，但是这种方法成本较高。而对于大菱鲆没有基因组信息，多利用已知的EST序列自行筛选，如西班牙Manuel Vera等(Aquaculture2011)发表的Validation of single nucleotide polymorphism(SNP)markers froman immune Expressed Sequence Tag(EST)turbot,Scophthalmus maximus,database，曾报道基于EST序列开发大菱鲆SNP标记的方法，他运用基于四种可能核苷酸两步反应法对候选SNP荧光检测进行基因分型验证，共筛选出77个大菱鲆SNP标记；但是EST序列与实际序列有一定差异，所以这种方法前期准备工作比较艰巨，开发效率比较低，覆盖率不够广，目的性不够强。高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting,HRM)，是近年来兴起的一种SNP检测的新工具，可以迅速的检测出DNA片段中碱基的突变，但在本发明之前，大菱鲆均采用非标记探针基因分型技术，刘庆明等发表的“应用高分辨率溶解曲线(HRM)开发大菱鲆(Scophthalmus maximus)SNP标记的研究“，但是探针设计常有误差，而且不对称PCR的操作复杂，成本较高，效率较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种大菱鲆S11单核苷酸多态性标记的检测方法，该方法费用低、特异性准确性高、重复性好、操作简便，可快速高通量地检测大菱鲆S11SNP标记。

本发明是按如下技术方案实现的：

一种大菱鲆S11单核苷酸多态性标记的检测方法，包括：1)、基因组DNA提取；2)、候选SNP筛选；3)、小片段引物设计；4)、PCR扩增；5)、数据采集和6)、基因分型；

所述的候选SNP筛选；通过高通量转录组测序获得SNP位点，采用人工筛查：①因为客观上测序错误的存在，因而只在含有不少于20个reads的contig中寻找SNP。②从突变频率大于20％的SNP位点中挑选，但当reads数大于500时，选择突变频率大于10％的SNP位点。筛查出候选S11SNP位点，其位点所在的conting为comp32333_c1_seq1，部分基因序列为：AAAAGTTGTTTTAATACTGATACAAGGAGGACAGAAGAGTCACAACACAACCATGTGTTCTCCTGAGACCAATGGTTACGAATAGACGAGGCCCCATTCAGTGGTTTCAGGCACTGACAAAAAGAATGAAAAAAGAAAACAGAGCTCAGAAACCATACTCCTCCGTTAGGTCGGAAAAGGTAAA GTCATAGTCATCAACGTCGTCATCGTCATCACCACTGAGAAGGGTCATGGCTATGAAAAAATTAAGTAGATCTAAGCCATCGTAGTCGTCTTCATCTTCTGTAGGATATGTAAATGATCTGCGACGTGTAGATTTATCATGTCGATAAAGGCACTCCGTTTTGAAGGGGCAGCAT，其中加粗、加下划线的碱基即为S11SNP位点；

所述的小片段引物设计：利用软件primer5.0进行引物设计，小片段法引物设计要求：①引物长度20bp左右；②目的片段控制在40bp-80bp；③引物内部不能包含SNP位点；④GC含量40％-60％，Tm值在40℃-60℃，两条引物之间Tm值相差不超过2℃；⑤引物3’末端不能够有连续超过4个碱基的错配或者自身配对；⑥目的产物只含有一个待测SNP位点。通过软件Oligo7.0检查引物质量，不能有严重错配、引物二聚体和发夹结构等。高低温内标为两段长度50bp的DNA片段，提供独立于PCR产物的大约68℃和88℃的熔解曲线，有效的去除混杂变量，减少Tm值对反应体积的依赖，增加基因分型的敏感性，内标序列分别为