[发明专利]从卵清蛋白中制备N-连接聚糖的高效分离制备及聚糖

摘要

本发明提供了一种卵清蛋白N‑连接聚糖组分的高效分离制备方法，其主要的成分是只有一个氨基酸即天冬酰胺(Asn)连接的N‑连接聚糖组分，工艺过程为将卵清蛋白用非特异性蛋白酶酶解后，离心浓缩，浓缩液用一维色谱柱去除卵清蛋白酶解后的多肽及残余蛋白，收集目标馏分。将收集到的馏分离心浓缩，将浓缩液通过二维色谱柱，除去馏分中的盐、2‑4个氨基酸连接的N‑连接聚糖组分以及小分子氨基酸，得到只有天冬酰胺连接的N‑连接聚糖组分。本发明制备的Asn连接的N‑连接聚糖组分，通过高分辨质谱鉴定，N‑连接聚糖组分明确，提取分离工艺过程重复性高、可操作性好，适用于从卵清蛋白中大规模分离制备N‑连接聚糖组分。

主权项

1.从卵清蛋白中制备N‑连接聚糖的高效分离制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1）蛋白变性：卵清蛋白样品中加入尿素的缓冲溶液进行反应，反应产物中加入二硫苏糖醇进行反应，产物中加入碘代乙酸，避光反应得到变性蛋白溶液；2）酶解：向非特异性链霉蛋白酶Pronase E的缓冲溶液中加入步骤1）得到的变性蛋白溶液，进行酶解反应；3) 酶解反应产物进行二维液相色谱分离制备，收集的组分干燥后即为天冬酰胺(Asn)连接的N‑连接聚糖组分；所述步骤3）以硅胶基质键合材料为色谱柱填料，二维液相色谱分离制备中，一维色谱柱所用的硅胶基质键合材料为C18为基质的极性共聚反相填料，二维色谱柱所用的硅胶基质键合材料为以C18为基质的极性共聚亲水填料；所述的二维液相色谱分离制备中一维制备采用的硅胶基质键合材料的粒度为5‑10微米，一维液相色谱柱的规格为：3mm×250mm、4.6mm×150mm、4.6mm×250mm或2.1mm×150mm中的一种，一维液相色谱制备采用的流动相为甲醇或乙腈与水相的混合，其中，甲醇或乙腈为有机相，其中不含有或含有0.1wt%甲酸，水相中不含有或含有0.1wt%甲酸；洗脱条件按照有机相5‑20%等度或5‑50分钟有机相由5%提高到30%梯度进行；柱温为25‑40℃，洗脱液流速为0.2‑1.0 mL/min，收集保留时间为0‑10 min的组分；二维制备采用的硅胶基质键合材料的粒度为3‑5微米，二维液相色谱柱的规格为：3mm×150mm、4.6mm×150mm、4.6mm×250mm或2.1mm×150mm中的一种，采用的流动相为有机相乙腈与水相水混合，洗脱条件按水相10‑50%V/V等度或经5‑30分钟水相由10‑15%提高到30‑60%梯度进行，柱温为25‑40℃，洗脱液流速为0.2‑1.0 mL/min，收集保留时间为5‑25的组分。