[发明专利]从卵清蛋白中制备N-连接聚糖的高效分离制备及聚糖

权利要求书

1.从卵清蛋白中制备N-连接聚糖的高效分离制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）蛋白变性：卵清蛋白样品中加入尿素的缓冲溶液进行反应，反应产物中加入二硫苏糖醇进行反应，产物中加入碘代乙酸，避光反应得到变性蛋白溶液；

2）酶解：向非特异性链霉蛋白酶Pronase E的缓冲溶液中加入步骤1）得到的变性蛋白溶液，进行酶解反应；

3) 酶解反应产物进行二维液相色谱分离制备，收集的组分干燥后即为天冬酰胺(Asn)连接的N-连接聚糖组分；

所述步骤3）以硅胶基质键合材料为色谱柱填料，二维液相色谱分离制备中，一维色谱柱所用的硅胶基质键合材料为C18为基质的极性共聚反相填料，二维色谱柱所用的硅胶基质键合材料为以C18为基质的极性共聚亲水填料；

所述的二维液相色谱分离制备中一维制备采用的硅胶基质键合材料的粒度为5-10微米，一维液相色谱柱的规格为：3mm×250mm、4.6mm×150mm、4.6mm×250mm或2.1mm×150mm中的一种，一维液相色谱制备采用的流动相为甲醇或乙腈与水相的混合，其中，甲醇或乙腈为有机相，其中不含有或含有0.1wt%甲酸，水相中不含有或含有0.1wt%甲酸；洗脱条件按照有机相5-20%等度或5-50分钟有机相由5%提高到30%梯度进行；柱温为25-40℃，洗脱液流速为0.2-1.0 mL/min，收集保留时间为0-10 min的组分；二维制备采用的硅胶基质键合材料的粒度为3-5微米，二维液相色谱柱的规格为：3mm×150mm、4.6mm×150mm、4.6mm×250mm或2.1mm×150mm中的一种，采用的流动相为有机相乙腈与水相水混合，洗脱条件按水相10-50%V/V等度或经5-30分钟水相由10-15%提高到30-60%梯度进行，柱温为25-40℃，洗脱液流速为0.2-1.0 mL/min，收集保留时间为5-25的组分。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中蛋白样品在尿素的缓冲溶液中进行的反应条件为20-30℃温育，缓冲溶液pH值为7-9，反应时间为1-5小时；加入二硫苏糖醇后反应条件为35-40℃温育，反应时间为1-5小时；加入碘代乙酸后的反应条件为避光20-30℃温育，反应时间为10-60分钟。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）缓冲溶液中尿素的浓度为4-10 M；所使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，浓度为30-80 mM；缓冲溶液中加入的蛋白与尿素的质量比为1:1-1:36；二硫苏糖醇的浓度为30-100 mM，蛋白与二硫苏糖醇的质量比为16:1-162:1；碘代乙酸的浓度为30-100 mM，蛋白与碘代乙酸的质量比为18:1-270:1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）酶解反应温度为35-40℃，缓冲溶液pH为4-7，反应时间为12-72小时；酶解后，酶解液需要在沸水中煮5-10分钟使酶失活。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤2）中所述缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液，pH值为4-7；缓冲溶液使用量体积为变性蛋白溶液体积的3-10倍；酶和初始卵清蛋白的质量比为0.5:1-10:1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：一维制备流动相为乙腈或含0.1wt%甲酸的乙腈与水或含0.1wt%甲酸的水，采用等度方式，乙腈体积比例为5%-15%；二维制备流动相为乙腈或含0.1wt%甲酸的乙腈与水或含0.1wt%甲酸的水，采用梯度条件，水或含0.1wt%甲酸体积浓度为15%经15-20分钟增加到30%-40%。