[发明专利]从卵清蛋白中制备N-连接聚糖的高效分离制备及聚糖

说明书

本发明提供了一种卵清蛋白N‑连接聚糖组分的高效分离制备方法，其主要的成分是只有一个氨基酸即天冬酰胺(Asn)连接的N‑连接聚糖组分，工艺过程为将卵清蛋白用非特异性蛋白酶酶解后，离心浓缩，浓缩液用一维色谱柱去除卵清蛋白酶解后的多肽及残余蛋白，收集目标馏分。将收集到的馏分离心浓缩，将浓缩液通过二维色谱柱，除去馏分中的盐、2‑4个氨基酸连接的N‑连接聚糖组分以及小分子氨基酸，得到只有天冬酰胺连接的N‑连接聚糖组分。本发明制备的Asn连接的N‑连接聚糖组分，通过高分辨质谱鉴定，N‑连接聚糖组分明确，提取分离工艺过程重复性高、可操作性好，适用于从卵清蛋白中大规模分离制备N‑连接聚糖组分。

技术领域

本发明涉及从蛋白中分离制备N-连接聚糖组分的提取分离制备，具体的说是从卵清蛋白中酶解分离制备得到带有一个天冬酰胺(Asn)的N-连接聚糖组分，该组分中的聚糖为5-15个甘露糖、半乳糖或N-乙酰葡萄糖胺组成，分子量在1000-3000。

背景技术

糖蛋白广泛存在于动物、植物、微生物及病毒中，是糖链以共价键的方式与蛋白质结合而形成的复合物。蛋白质糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，在真核生物，尤其是哺乳动物中约有一半以上的蛋白质是被糖基化的，膜蛋白则几乎100％是以糖基化的形式而存在(Apweiler R,Hermjakob H,Sharon N,On the frequency of proteinglycosylation,as deduced from analysis of the SWISS-PROT database.BiochimBiophys Acta-Gen Subj,1999,1473,4-8)。糖基化作为一种主要的蛋白质翻译后修饰形式，对蛋白质的结构和功能有着重要影响，如蛋白质的折叠、运输以及定位等。已知在细胞膜表面存在大量的糖蛋白，糖蛋白的糖链在细胞间的识别、黏附、通信联络以及免疫应答等方面均起着重要作用。除此之外，蛋白质糖基化的异常与肿瘤、发育、免疫异常以及感染等疾病的发生发展和诊断治疗也有密切关系。目前，已知肿瘤、类风湿等疾病会引起糖链结构的异常改变，因此，糖链被认为是一种潜在的疾病标志物和新疫苗的靶点(Ohtsubo K,Marth JD,Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.Cell2006,126,855-867；Kim EH,Misek DE,Glycoproteomics based identification ofcancer biomarkers.International journal of Proteomics,2011,2011,1-10.)。由于糖肽部分在酶解后肽段中所占比例非常小，(约2-5％)，其质谱响应很容易被高丰度非糖肽抑制。另外，由于糖链的微观不均一性，一个糖基化位点上的糖链类型可能多达几十种，进一步降低了糖链的相对量而使得它们很难被检测到，这些使得糖链的分离制备变得异常艰难。尽管糖链不容易得到，但是去除了蛋白质中非糖肽、磷酸化肽及其它肽段的影响，在高纯度糖链基础上，研究糖链的结构信息，发现一些潜在的诊断标志物和治疗靶点将会变得简便、直接，更容易获得准确的结果，因此对于糖链的分离制备迫切需求一种高效、高通量的分离制备方法。

酶法释放糖蛋白糖链因方法简单、条件温和、能够提供有关糖链残基组成、排列顺序和糖苷键的构型等信息，目前应用较广。较常用的释放N-糖链的特异蛋白酶有N-糖肽酶F(PNGase F)，经PNGase F酶解能够得到完整的N-糖链，但由于糖链本身没有发色基团，不能直接用HPLC及LC-MS等进行分析，因此需要通过柱前衍生法使糖链带上紫外或荧光基团。但是衍生后的糖链会形成还原端开环结构，导致糖链的部分生物信息丢失，同时对糖链的一些活性造成影响。