[发明专利]一种重组人生长激素的制备方法有效
申请号: | 201410405824.7 | 申请日: | 2014-08-15 |
公开(公告)号: | CN104151422B | 公开(公告)日: | 2019-08-09 |
发明(设计)人: | 刘爽;孙晓悦;邓小霞;庞玉;王子华 | 申请(专利权)人: | 吉林金梓源生物科技股份有限公司 |
主分类号: | C07K14/61 | 分类号: | C07K14/61;C07K1/34 |
代理公司: | 上海百一领御专利代理事务所(普通合伙) 31243 | 代理人: | 马育麟 |
地址: | 136400 吉林省四平市双辽市经*** | 国省代码: | 吉林;22 |
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摘要: | 本发明公开了一种在大肠杆菌中以包涵体形式表达重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhHGH)的制备方法,其包括如下主要步骤:高压匀浆破碎菌体细胞、包涵体漂洗,尿素变性溶解所述包涵体、控速分级复性该包涵体蛋白、离心、超滤膜浓缩、过滤除菌、冷冻干燥制成成品等步骤。通过本发明的制备方法所制备的重组人生长激素蛋白具有纯度高、活性高的优点。本发明的制备方法利用蛋白质的控速分级复性进行复性和尿素变性、通过超滤膜技术即可制备纯度高、活性高的重组人生长激素蛋白。同时可以省略层析步骤,大大缩短了工时、降低了生产成本。本发明可高效、简便、低成本地获得rhHGH纯品。 | ||
搜索关键词: | 一种 重组 人生 激素 制备 方法 | ||
【主权项】:
1.一种在大肠杆菌中以包涵体形式表达重组人生长激素的制备方法,其中,所述的方法包括的步骤如下:1)新发酵获得的重组人生长激素大肠杆菌细胞,于高压匀浆机中,在≤10℃条件下进行破菌;2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心,离心1小时,弃除清液,收集固体沉淀;3)沉淀转移至搅拌罐中,加入10‑30倍含0.1%的曲拉通X‑100的去离子水搅拌,调pH值为7.0,在≤20℃搅拌2小时;4)重复步骤2)和3)2‑3次,得沉淀;5)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比50倍的含1mM Beta‑巯基乙醇的8M尿素溶液,搅拌2‑4小时使蛋白变性溶解;6)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心,离心0.5小时,收集澄清液体,弃除产生的少量黑色沉淀杂质;7)澄清液体转移到搅拌罐中,边搅拌边加入等体积4M的尿素,添加尿素的流速为15mL/分钟,最后尿素浓度降为6M;8)边搅拌边加入步骤7)总量等体积的1M尿素,添加尿素的流速为15mL/分钟,这时尿素浓度为3.5M;9)边搅拌边加入步骤8)总量等体积的纯净水,添加水的流速为15mL/分钟,这时尿素浓度为1.75M;10)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心,离心0.5小时,收集澄清液体;11)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩,到1/8体积;12)加入去离子水到原体积,重复步骤11)6次以上,再加入去离子水到原体积;13)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤;14)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩,到1/20体积;15)用除菌过滤机除菌,冷冻干燥,分装得成品。
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