[发明专利]一种结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒

摘要

一种应用于生物医学临床诊断领域中的结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒，试剂盒包括磁珠法核酸提取试剂盒和TB核酸扩增试剂盒，其中磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液、洗脱液、磁珠液；TB核酸扩增试剂盒包括TB‑PCR反应液、酶混合液、TB‑内标、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品；所述TB核酸扩增试剂盒中TB‑PCR反应液包括用于检测靶基因和内标的探针、用于扩增靶基因和内标的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液。该发明无需高速离心及煮沸、操作简便快速、成本低廉，生物风险小，便于自动化和高通量检测；检测灵敏度高、特异性强、重复性好，避免出现假阴性和假阳性结果；引入高效的内标系统，能够高效的监控整个检测过程。

主权项

一种结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括磁珠法核酸提取试剂盒和TB核酸扩增试剂盒，其中磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液、洗脱液、磁珠液；TB核酸扩增试剂盒包括TB‑PCR反应液、酶混合液、TB‑内标、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品；所述磁珠法核酸提取试剂盒中裂解结合液组成为含有十二烷基肌氨酸钠0.5‑2.5%，TritonX‑100 0.5‑2.5ml/100ml，异硫氰酸胍2‑6.0mol/L，EDTA1‑10mM，HCl0.1‑0.3M，所述EDTA1‑10mM的PH为7.5；所述TB核酸扩增试剂盒中TB‑PCR反应液包括用于检测靶基因和内标的探针、用于扩增靶基因和内标的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液；TB核酸扩增试剂盒中用于检测靶基因的探针序列为：5‑ctgcccactccgaatcgtgctgacc‑3（SEQ ID NO:1），5'端标记为FAM荧光发生基团，3'端标记为BHQ1荧光淬灭基团；用于内标检测的探针序列为：5'‑CAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGC‑'3（SEQ ID NO:2），5'端标记为HEX荧光发生基团，3'端标记为BHQ1荧光淬灭基团；用于扩增靶基因的上游引物序列为：5‑tgcggatggtcgcagagatcc‑3（SEQ ID NO:3）；用于扩增靶基因的下游引物序列为：5‑agtagacgggcgacctcactg‑3（SEQ ID NO:4）；用于扩增内标的上游引物序列为：5'‑TTCGATCTCCGTCGAACCTTG‑'3（SEQ ID NO:5）；用于扩增内标的下游引物序列为：5'‑ttctcaggactccagtcgcTG‑'3（SEQ ID NO:6）；所述磁珠法核酸提取试剂盒中漂洗液组成为含有Triton X‑100 0.5‑2.0ml/100ml，氯化钠0.1‑0.3mol/L，60‑80%乙醇；所述磁珠法核酸提取试剂盒中洗脱液组成为含有10mmol/L Tris‑HCl，所述10mmol/L Tris‑HCl的PH为8.3，0.01‑0.05% Prolin300；所述磁珠法核酸提取试剂盒中磁珠液组成为直径为1μm的氧化硅超顺纳米磁珠，浓度为10‑40mg/ml；所述TB核酸扩增试剂盒中酶混合液包括热启动Taq酶、尿嘧啶糖基化酶（UNG）；其中热启动Taq酶的用量为3‑8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05‑0.2U/人份；所述试剂盒中TB内标是将序列5'‑TTCGATCTCCGTCGAACCTTGCACTCTGCATCCTGGACTCATGCTGACTGCAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGCTCTACTGCACTCCTGCGTCATCACgcgactggagtcctgagaa‑'3（SEQ ID NO:7）插入到pUC18T载体而构成的重组体；TB内标质粒使用浓度为100‑500copies/次。