[发明专利]高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法

摘要

一种高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，包括无菌幼胚的获取、启动培养、增殖培养、刺葡萄愈伤组织高产原花青素细胞系的筛选，以及长期继代保持所筛选的高产原花青素的愈伤组织等内容。本发明不仅能够快速获得大量刺葡萄愈伤组织，且所获得的刺葡萄愈伤组织具有高诱导效率、生长旺盛和高产原花青素的优点，同时可长期继代保持刺葡萄愈伤组织，即具有旺盛的生长能力，从而为刺葡萄生物技术和细胞培养生产次生代谢产物等研究奠定了良好的基础。

主权项

一种高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)无菌幼胚的获取：剪取花后20～30天的整串刺葡萄幼果，去除果穗和果柄，置入加有洗涤剂的自来水中浸泡30min，冲洗干净，自然晾干；将幼果用75％酒精浸泡30s，接着用0.1％升汞溶液灭菌15min，再用无菌水冲洗5次，最后将灭菌好的刺葡萄幼果，小心切开，取出完整的幼胚；(2)启动培养：取所述幼胚，将该幼胚以平放的方式接种至诱导愈伤组织的诱导培养基中，然后于培养室中黑暗条件下培养35天，得到初代愈伤组织；(3)增殖培养：将初代愈伤组织转接到继代增殖培养基中，并于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下进行继代增殖培养，直至获得生长一致且生长旺盛的刺葡萄愈伤组织；(4)筛选：从步骤(3)所获得的刺葡萄愈伤组织中，选取质地松脆、颜色为紫红色的刺葡萄愈伤组织，剥去紫红色表层，选取里层的愈伤组织接种至附加1.5mg/L2,4‑二氯苯氧基乙酸的MS固体培养基中，于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下培养20～25天，获得高产原花青素的愈伤组织；(5)长期继代保持：以培养20～25天的高产原花青素的愈伤组织为材料，于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下，采用两种继代保持培养基交替继代培养，并采用剥去所述愈伤组织紫红色表层细胞，选里层愈伤组织接种的方式，能长期继代保持高产原花青素的紫红色刺葡萄愈伤组织。