[发明专利]高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法。

背景技术

刺葡萄(Vitis davidii)是葡萄科葡萄属东亚种群的一个野生种，为落叶强大藤本植物，在我国南方广泛分布，向北分布至陕西南部。刺葡萄果实紫黑色，营养极为丰富，含有具保健功能的黄酮类化合物(主要是花青素和原花青素)、白黎芦醇、齐墩果酸、蹂质、超氧化物歧化酶(SOD)和维生素C等天然活性成分。刺葡萄果皮厚，种子多，在加工制汁和酿酒，以及从果皮、种子提取天然活性物质具有很好的应用前景。研究表明，刺葡萄果实中富含的花青素和原花青素(oligomeric proanthocyanidins，OPCs)有很强的清除自由基的能力，具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、保护心血管等方面的功能，尤其是原花青素，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。目前，天然的原花青素还主要来源于松树皮和葡萄籽，随着市场需求的不断扩大，原有的从葡萄、松树皮或其他替代植物中来源的生物活性物质已不能满足需要，必须寻求更多更可靠的材料来源。生物技术领域里一个重要分支的植物细胞培养，具有不受季节影响、生长周期短、产物均一可控、活性物质成分高于天然植物等优点，因此采用规模化的植物细胞培养是解决药用植物资源匮乏和药效成分低的药用植物以满足需求的重要途径。

近年来，植物细胞培养进行天然有效成分的生产已经取得了令人瞩目的成就。然而，刺葡萄的细胞培养还处在愈伤组织诱导和培养阶段，鲜见长期继代保持的报道；刺葡萄细胞培养还亟待解决细胞系的筛选、长期继代保持和悬浮细胞系建立等诸多问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，包括如下步骤：

(1)无菌幼胚的获取：剪取花后20～30天的整串刺葡萄幼果，去除果穗和果柄，置入加有洗涤剂的自来水中浸泡30min，冲洗干净，自然晾干；将幼果用75％酒精浸泡30s，接着用0.1％升汞溶液灭菌15min，再用无菌水冲洗5次，最后将灭菌好的刺葡萄幼果，小心切开，取出完整的幼胚；

(2)启动培养：取所述幼胚，将该幼胚以平放的方式接种至诱导愈伤组织的诱导培养基中，然后于培养室中黑暗条件下培养35天，得到初代愈伤组织；

(3)增殖培养：将初代愈伤组织转接到继代增殖培养基中，并于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下进行继代增殖培养，直至获得生长一致且生长旺盛的刺葡萄愈伤组织；

(4)筛选：从步骤(3)所获得的刺葡萄愈伤组织中，选取质地松脆、颜色为紫红色的刺葡萄愈伤组织，剥去紫红色表层，选取里层的愈伤组织接种至附加1.5mg/L2,4-D的MS固体培养基中，于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下培养20～25天，获得高产原花青素的愈伤组织；

(5)长期继代保持：以培养20～25天的高产原花青素的愈伤组织为材料，于温度23～25℃，光照强度1000～1500lx，每天光照10h的条件下，采用两种继代保持培养基交替继代培养，并采用剥去所述愈伤组织紫红色表层细胞，选里层愈伤组织接种的方式，能长期继代保持高产原花青素的紫红色刺葡萄愈伤组织。

进一步地，所述步骤(2)中的诱导培养基为：MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.0mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。

进一步地，所述步骤(3)中的继代增殖培养基为：MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。

进一步地，所述步骤(5)中的两种继代保持培养基为：MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，以及MS培养基+2,4-二氯苯氧基乙酸1.5mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。