[发明专利]一种检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本中病毒的cDNA；(3)检测：进行PCR扩增；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断气溶胶样本中是否含有口蹄疫病毒。本发明还公开了特异性引物(如SEQ ID NO.1～8所示)以及试剂盒(由特异性引物、RT反应缓冲液、AMV反转录酶、 Premix Ex Taq^TM II、标准阳性质粒、无RNase的水组成)。本发明的检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法及试剂盒既可用于养殖场气溶胶的口蹄疫病毒检测和血清型分型，也可用于临床样本的直接检测，还可用于科学研究等非疾病的诊断。

主权项

一种检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法，其特征在于：步骤如下：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本中病毒的cDNA；(3)检测：以上述提取的cDNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：所述试剂盒由特异性引物、RT反应缓冲液、AMV反转录酶、Premix Ex Taq^TM II、标准阳性质粒、无RNase的水组成；所述标准阳性质粒包括阳性质粒pEASY‑T3‑5’UTR、pEASY‑T3‑O‑VP1、pEASY‑T3‑A‑VP1和pEASY‑T3‑A1‑VP1；所述阳性质粒pEASY‑T3‑5’UTR是由SEQ ID NO.9所示序列的第28‑203位核苷酸的序列片段与pEASY‑T3载体相连接后得到的重组质粒；所述阳性质粒pEASY‑T3‑O‑VP1是由ID NO.10所示的序列片段与pEASY‑T3载体相连接后得到的重组质粒；所述阳性质粒pEASY‑T3‑A‑VP1是由SEQ ID NO.11所示的序列片段与pEASY‑T3载体相连接后得到的重组质粒；所述阳性质粒pEASY‑T3‑A1‑VP1是由SEQ ID NO.12所示的序列片段与pEASY‑T3载体相连接后得到的重组质粒；所述特异性引物选自口蹄疫病毒检测的通用引物对或/和O型、A型、Asia1型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对；所述口蹄疫病毒检测的通用引物对的序列如下：引物1‑5’UTR‑F：5’‑CGTTGCACTCCACACTTAC‑3’；引物2‑5’UTR‑R：5’‑GACCAAGTAGGCGGAAAG‑3’；O型、A型、Asia1型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下：O型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下：引物3‑O‑VP1F：5’‑GCAACTCAGGTCCAGAGGCGTC‑3’；引物4‑O‑VP1R：5’‑CAGTGTGTGAGCAGGGATCTGCATC‑3’；A型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下：引物5‑A‑VP1F：5’‑AGACACAGGCTCAGCGACGTC‑3’；引物6‑A‑VP1R：5’‑GGCTGCACGCAAAAGGGCACCCACC‑3’；Asia1型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下：引物7‑A1‑VP1F：5’‑GAAACTCAGACAGCCAGGCGGC‑3’；引物8‑A1‑VP1R：5’‑CGCAGACCGCAGCAGGCTCCAACC‑3’；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断：当所用特异性引物为口蹄疫病毒检测的通用引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有口蹄疫病毒；当所用特异性引物为O型、A型、Asia1型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对时，若对应于O型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有O型口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有O型口蹄疫病毒；若对应于A型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有A型口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有A型口蹄疫病毒；若对应于Asia1型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有Asia1型口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有Asia1型口蹄疫病毒。