[发明专利]一种检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过荧光定量SYBR Green I方法分型检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法，以及特异性引物、试剂盒，属于生物检测领域。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的猪、牛、羊等偶蹄类动物发生急性、热性、高度接触性传染病，一旦暴发，必须扑杀感染及接触感染的动物。口蹄疫被世界动物卫生组织列为法定报告疫病，被我国列为一类动物疫病之首，不仅会造成巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。

口蹄疫病毒有7个血清型和65个以上的血清亚型，血清型之间无交叉免疫现象，因而难以控制。我国为口蹄疫流行国家，主要流行O型、A型和Asia1型口蹄疫。2005年我国大面积爆发了Asia1型口蹄疫，2009年和2013年爆发了A型口蹄疫，近年来，均有O型口蹄疫的散发和流行，特别是随着我国养殖业集约化、规模化的迅猛发展，口蹄疫的传播风险也来越大。

由于养殖动物高度密集，患病动物呼出、排泄大量的病原微生物，造成舍内高浓度微生物气溶胶的积聚，而且通过舍内外气体的交换，病原微生物随着大气传播、扩散，造成环境生物污染和传染病传播。口蹄疫病毒能在空气中形成气溶胶，病毒可随风散播到50～100公里外的地方，传播速度快，距离远，难于防御。因此，通过建立一种适用于口蹄疫病毒气溶胶的检测方法，将为口蹄疫预报预警提供配套技术。

目前应用于气溶胶病毒的检测方法主要有培养法和分子生物学方法，实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的分子生物学方法，具有灵敏度和特异性高、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，可应用于病原微量检测。然而关于气溶胶的口蹄疫病毒荧光定量PCR检测及其分型方法未见报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种通过荧光定量SYBRGreenI方法分型检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法，以及特异性引物、试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法，步骤如下：

(1)采集气溶胶样本；

进一步地，采集气溶胶样本的方法为：采用MS-1型多功能微生物采样器，以10mL pH值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集30min，收集养殖场环境中的气溶胶样本；

(2)提取气溶胶样本中病毒的cDNA；

进一步地，提取cDNA的方法为：取2mL气溶胶样本，应用病毒RNA提取试剂盒(商业化产品，现有技术中的常规试剂盒)提取总RNA；再参照反转录试剂盒(商业化产品，现有技术中的常规试剂盒)说明书进行反转录，获得cDNA；

(3)检测：以上述提取的cDNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：

所述试剂盒由特异性引物、RT反应缓冲液、AMV反转录酶、Premix Ex Taq^TM II、标准阳性质粒、无RNase的水组成。

所述标准阳性质粒包括阳性质粒pEASY-T3-5’UTR、pEASY-T3-O-VP1、pEASY-T3-A-VP1和pEASY-T3-A1-VP1；用于标准曲线的制备及气溶胶口蹄疫病毒拷贝数的计算。

所述阳性质粒pEASY-T3-5’UTR是由SEQ ID NO.9所示序列的第28-203位核苷酸的序列片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术。

所述阳性质粒pEASY-T3-O-VP1是由ID NO.10所示的序列片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术。

所述阳性质粒pEASY-T3-A-VP1是由SEQ ID NO.11所示的序列片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术。

所述阳性质粒pEASY-T3-A1-VP1是由SEQ ID NO.12所示的序列片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术。

所述特异性引物选自口蹄疫病毒检测的通用引物对或/和O型、A型、Asia1型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对；

所述口蹄疫病毒检测的通用引物对的序列如下：

引物1-5’UTR-F：5’-CGTTGCACTCCACACTTAC-3’(SEQ ID NO.1)；