[发明专利]一种检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)采集气溶胶样本；

(2)提取气溶胶样本中病毒的cDNA；

(3)检测：以上述提取的cDNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：

所述试剂盒由特异性引物、RT反应缓冲液、AMV反转录酶、Premix Ex Taq^TM II、标准阳性质粒、无RNase的水组成；

所述标准阳性质粒包括阳性质粒pEASY-T3-5’UTR、pEASY-T3-O-VP1、pEASY-T3-A-VP1和pEASY-T3-A1-VP1；

所述阳性质粒pEASY-T3-5’UTR是由SEQ ID NO.9所示序列的第28-203位核苷酸的序列片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒；

所述阳性质粒pEASY-T3-O-VP1是由ID NO.10所示的序列片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒；

所述阳性质粒pEASY-T3-A-VP1是由SEQ ID NO.11所示的序列片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒；

所述阳性质粒pEASY-T3-A1-VP1是由SEQ ID NO.12所示的序列片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒；

所述特异性引物选自口蹄疫病毒检测的通用引物对或/和O型、A型、Asia1型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对；

所述口蹄疫病毒检测的通用引物对的序列如下：

引物1-5’UTR-F：5’-CGTTGCACTCCACACTTAC-3’；

引物2-5’UTR-R：5’-GACCAAGTAGGCGGAAAG-3’；

O型、A型、Asia1型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下：

O型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下：

引物3-O-VP1F：5’-GCAACTCAGGTCCAGAGGCGTC-3’；

引物4-O-VP1R：5’-CAGTGTGTGAGCAGGGATCTGCATC-3’；

A型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下：

引物5-A-VP1F：5’-AGACACAGGCTCAGCGACGTC-3’；

引物6-A-VP1R：5’-GGCTGCACGCAAAAGGGCACCCACC-3’；

Asia1型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的序列如下：

引物7-A1-VP1F：5’-GAAACTCAGACAGCCAGGCGGC-3’；

引物8-A1-VP1R：5’-CGCAGACCGCAGCAGGCTCCAACC-3’；

(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；

(5)判断：当所用特异性引物为口蹄疫病毒检测的通用引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有口蹄疫病毒；

当所用特异性引物为O型、A型、Asia1型3种血清型口蹄疫病毒鉴别检测引物对时，若对应于O型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有O型口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有O型口蹄疫病毒；

若对应于A型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有A型口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有A型口蹄疫病毒；

若对应于Asia1型口蹄疫病毒鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有Asia1型口蹄疫病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有Asia1型口蹄疫病毒。

2.根据权利要求1所述的检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，采集气溶胶样本的方法为：采用MS-1型多功能微生物采样器，以10mLpH值7.0的磷酸盐缓冲液为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集30min，收集气溶胶样本。

3.根据权利要求1所述的检测气溶胶中口蹄疫病毒的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，提取cDNA的方法为：取2mL气溶胶样本，应用病毒RNA提取试剂盒提取总RNA；再应用反转录试剂盒进行反转录，获得cDNA。