[发明专利]一种葡萄酒酿造用微生物的高通量筛选方法

摘要

本发明公开了一种葡萄酒酿造用微生物的高通量筛选方法，该方法利用高通量筛选设备，先在选择性固体培养基上对具有特定菌落形态或酿造特性的菌株进行初筛，再利用微孔板对初筛得到的菌株进行微型发酵复筛，将复筛得到的菌株进行微型发酵，然后将得到的发酵液进行代谢物分析和多元统计分析，对复筛得到的菌株进行代谢框架归集分组，将不同归集分组的菌株进行小试发酵，并利用理化检测和感官评定确定适合作为葡萄酒酿造用微生物的菌株。本发明方法能够快速、准确而简便地筛选出适合特定产地、特定葡萄品种或特定酿造需求的葡萄酒酿造用微生物，从而大大降低实验工作量，节约70%以上的人力，并将研发周期从1‑3年降低至4‑6个月。

主权项

1.一种葡萄酒酿造用微生物的高通量筛选方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)将葡萄样品依次进行无菌取样、破碎和带皮自然发酵，取样并进行稀释，将稀释的发酵液均匀涂布在特定培养基上进行培养获得所需筛选的微生物，利用高通量筛选设备对培养基上的菌落进行筛选；(2)将步骤(1)筛选得到的菌株直接点种在选择性固体培养基上进行培养，利用高通量筛选设备对培养基上的菌落进行初筛；(3)利用微孔板对初筛得到的菌株进行微型发酵复筛，对复筛得到的菌株进行微型发酵，发酵结束后对得到的发酵液进行代谢物分析和多元统计分析，对复筛得到的菌株进行代谢框架分组，通过分组将具有相同/相似代谢框架的菌株进行归集；(4)将归集为不同分组的菌株进行小试发酵，利用理化检测和感官评定确定适合作为葡萄酒酿造用微生物的菌株，并对该菌株进行鉴定；其中，所需筛选的微生物为酿酒酵母，所述带皮自然发酵至发酵液中残糖含量为4‑100g/L、苹果酸含量为2‑15g/L时进行取样；在步骤(1)中，所述特定培养基为mWL固体培养基，利用高通量筛选设备筛选出具有酿酒酵母菌落形态的菌株；在步骤(2)中，将步骤(1)筛选得到的菌株点种在选自ESA固体培养基、BIGGY固体培养基、产β‑葡萄糖苷酶活性菌株筛选固体培养基和产果胶酶活性菌株筛选固体培养基中的一种或多种的选择性固体培养基上进行一轮或多轮培养；在步骤(3)中，所述微型发酵复筛的方法包括将步骤(2)中初筛得到的菌株转接到含第一培养液的微孔板中微型发酵并进行1‑3轮复筛；所述第一培养液为未经过酒精发酵的葡萄糖含量为200‑260g/L的白葡萄汁或去皮后破碎的红葡萄汁；所述1‑3轮复筛的方法包括：在第1轮复筛时，检测微型发酵过程中每孔板内OD620，筛选出OD62024h‑OD6200h≥0.4的菌株；在第2轮复筛时，筛选出发酵终点的残糖含量≤4g/L的菌株；在第3轮复筛时，将第2轮复筛得到的菌株进行微型发酵并将得到的发酵液以5％‑20％体积比的接种量转接至含第二培养液的深孔微孔板中进行微型发酵，并对所述第3轮复筛中得到的发酵液进行代谢物分析和多元统计分析；所述第二培养液为未经过酒精发酵的葡萄糖含量为200‑260g/L的白葡萄汁和红葡萄汁；或者，所需筛选的微生物为酒类酒球菌，所述带皮自然发酵至发酵液中残糖含量为1‑4g/L、苹果酸含量为0.5‑2.0g/L时进行取样；在步骤(1)中，所述特定培养基为mMLO固体培养基，利用高通量筛选设备筛选出具有酒类酒球菌菌落形态的菌株；在步骤(2)中，将步骤(1)筛选得到的菌株点种在选自mMLOTEC固体培养基、产生物胺检测固体培养基和柠檬酸利用检测固体培养基中的一种或多种的选择性固体培养基上进行一轮或多轮培养；在步骤(3)中，所述微型发酵复筛的方法包括将步骤(2)中初筛得到的菌株转接到含第一培养液的微孔板中微型发酵并进行1‑3轮复筛；所述第一培养液为未经过苹乳发酵的白葡萄酒或用去皮破碎红葡萄汁发酵得到的红葡萄酒；所述1‑3轮复筛的方法包括：在第1轮复筛时，检测微型发酵过程中每孔板内OD620，筛选出OD62048h‑OD6200h≥0.4的菌株；在第2轮复筛时，筛选出发酵终点的苹果酸含量≤500mg/L的菌株；在第3轮复筛时，将第2轮复筛得到的菌株进行微型发酵并将得到的发酵液以5％‑20％体积比的接种量转接至含第二培养液的深孔微孔板中进行微型发酵，并对所述第3轮复筛中得到的发酵液进行代谢物分析和多元统计分析；所述第二培养液为未经过苹乳发酵的残糖含量≤4g/L、苹果酸含量≤10g/L的白葡萄酒和红葡萄酒。