[发明专利]一种葡萄酒酿造用微生物的高通量筛选方法

说明书

本发明公开了一种葡萄酒酿造用微生物的高通量筛选方法，该方法利用高通量筛选设备，先在选择性固体培养基上对具有特定菌落形态或酿造特性的菌株进行初筛，再利用微孔板对初筛得到的菌株进行微型发酵复筛，将复筛得到的菌株进行微型发酵，然后将得到的发酵液进行代谢物分析和多元统计分析，对复筛得到的菌株进行代谢框架归集分组，将不同归集分组的菌株进行小试发酵，并利用理化检测和感官评定确定适合作为葡萄酒酿造用微生物的菌株。本发明方法能够快速、准确而简便地筛选出适合特定产地、特定葡萄品种或特定酿造需求的葡萄酒酿造用微生物，从而大大降低实验工作量，节约70%以上的人力，并将研发周期从1‑3年降低至4‑6个月。

技术领域

本发明涉及葡萄酒酿造领域，具体地，涉及一种葡萄酒酿造用微生物的高通量筛选方法。

背景技术

葡萄酒是指以新鲜葡萄或葡萄汁为原料，人工或天然接种酵母菌后，将糖全部或部分发酵转化成乙醇的饮料酒。葡萄酒酿造是一个复杂的微生物学过程，其中酵母菌是占主导地位的微生物。葡萄酒的酒精发酵主要是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的作用下，采用自然发酵、纯种发酵或混合发酵，将葡萄汁中的营养成分转化成酒精和其他风味物质的过程。除了酿酒酵母外，在葡萄汁自然发酵的前期和中期还存在着很多不同种属的非酿酒酵母类酵母。这些微生物中的某些种已被证明在葡萄酒酿造初期，甚至发酵中期存在较大数量，起到诱发酒精发酵的作用，并且对葡萄酒的香气、风味产生重大影响，但在酒精发酵后期，非酿酵母的种类和数量都急剧下降。因此，可以将酿酒酵母对酒精和SO₂的抗性能力作为与其它酵母菌株进行区分的初步筛选依据之一。

酒精发酵结束后，绝大多数葡萄酒需要继续进行苹乳发酵，以将口味酸涩的苹果酸转化为口感柔和的乳酸和二氧化碳。在这一过程中乳酸菌起到了不可替代的作用。在苹乳发酵自然启动的葡萄酒中，存在不同种类的耐受高浓度乙醇乳酸菌，如酒类酒球菌（Oenococcus oeni）、植物乳杆菌和乳酸片球菌等。其中酒类酒球菌往往是最占优势的菌群。但是，自然条件下引发的苹乳发酵却存在着极大的不确定性，有时会造成发酵迟滞甚至停止，进而造成酒质败坏，甚至产生生物胺和氨基甲酸乙酯等有害物质。因此，在酒精发酵结束的葡萄酒中，人工接种适当的乳酸菌是目前经常采用的方法。在大多数经过商业化生产的苹乳发酵剂菌株中，酒类酒球菌最为常见。

据国际葡萄与葡萄酒组织(OIV)统计，2012年全世界葡萄酒消费总量约为247.2亿升至2547亿升。进入新千年后，中国葡萄酒产量一直保持两位数的增幅。2012年，全国葡萄酒的产量约为22亿升，同比增长16.9%。但是，我们不得不承认，如此之大的葡萄酒产量，却几乎全部由进口葡萄酒发酵剂酿造而成。目前世界比较著名的葡萄酒产地，如法国、西班牙、意大利等国非常重视本土优良葡萄酒酿造菌种的选育和特性研究，使得这些国家的发酵剂在世界上广受欢迎，享有很高的声誉，同时也给这些国家带来了巨大的经济和社会效益。而中国在这方面的发展则相对滞后，至今国产葡萄酒发酵剂在市场上仍十分罕见，这使得我国国产葡萄酒缺乏产地特色，与外国进口葡萄酒同质化问题严重，限制了国产葡萄酒的发展。此外，由于葡萄品种、栽培环境及工艺条件等差异，引入菌种并不能完全表现出其良好品质，这样会导致国产葡萄酒质量不稳定，给葡萄酒企业带来不同程度的经济影响。造成国产葡萄酒发酵剂研究一直滞后的重要原因是传统手工筛选方法的工作量大、研发周期长，需要耗费大量人力、物力和时间。