[发明专利]一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取及纯化方法

摘要

本发明公开了一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取及纯化方法，该方法直接从燕麦种子提取DNA，在提取过程中，利用50ml离心管取材提取DNA；并且CTAB提取缓冲液浓度为3%，较常规方法增加了1%；且提取过程中分别用酚‑氯仿（VV=11）溶液和氯仿‑异戊醇（VV=241）溶液各抽提一次；纯化过程中又用氯仿‑异戊醇（VV=241）溶液纯化抽提一次，成功的提取出了高纯度、高质量的燕麦基因组DNA，省去了种子发芽成苗的周期，所提DNA产量和质量完全满足进一步的PCR分析。并将应用该法提取的DNA样品成功地运用于燕麦SSR分子标记，为进一步开展燕麦分子遗传研究奠定基础。

主权项

一种适于PCR扩增的燕麦种子DNA大量提取及纯化方法，其特征是，所述提取方法包括以下步骤:(1)选取燕麦干种子于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末，将粉末放入第一离心管中；(2)向第一离心管中加入经65℃预热的提取缓冲液充分颠倒混匀，提取缓冲液成分为3％CTAB、0.1mol/L pH 8.0的Tris‑HCl、1.4mol/L NaCl、0.02mol/L pH8.0的EDTA、1％PVP、1％β‑巯基乙醇，提取缓冲液的加入量为20‑22ml；(3)将第一离心管置于65℃中进行水浴，水浴1.5小时，水浴其间每10min温和的颠倒混匀一次；(4)取出第一离心管，加入等体积的酚‑氯仿溶液，酚‑氯仿溶液中，酚和氯仿的体积比为1:1，温和颠倒混匀，离心；(5)离心结束后用吸管吸取上清液，装入第二离心管，加入等体积的氯仿‑异戊醇溶液，氯仿‑异戊醇溶液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1，充分颠倒混匀，离心；(6)离心结束后将上清液移入第三离心管中，加入预冷的异丙醇，异丙醇的加入量为上清液体积的0.6‑1倍，轻轻混匀，低温静置；(7)勾出DNA到第四离心管中，并用70％的乙醇冲洗2～3次；(8)用冷冻干燥机干燥DNA至无乙醇味，再加入1×TE 500μl，RNase 3‑5μl，37℃水浴1‑2h；其中，步骤(2)至步骤(6)中，所用到的第一离心管、第二离心管及第三离心管均为50ml离心管；步骤(4)和步骤(5)中的离心条件为6000‑8000rpm，离心时间为5‑10min；所述纯化方法包括以下步骤：(1)取出提取过程中步骤(8)中提取到DNA的第四离心管，加入氯仿‑异戊醇，氯仿‑异戊醇溶液中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1，轻轻混匀，12000rpm条件下离心5min；(2)离心结束后，取上清液于第二支离心管，加相对于上清液0.1倍体积的3M醋酸钠，混匀后加入相对于上清液2倍体积的预冷无水乙醇，轻摇混匀，低温静置；(3)用移液器吸头勾出DNA至第三支离心管，然后用70％的乙醇冲洗2‑3次；(4)将第三支离心管放入冷冻干燥机中，干燥DNA至无乙醇味，依所提DNA的量加入适量的1×TE溶解，使其终浓度为190‑210ng/μL。